局晚期直肠癌术后复发风险相关标记物、评价装置以及计算机可读介质制造方法及图纸

本发明专利技术涉及用于局晚期直肠癌术后复发风险监测相关的标志物，属于医学分子生物学技术领域。通过对于局晚期直肠癌患者确诊活检组织，手术组织和切缘组织样本进行NGS测序，并在术后定期随访，分析发现了可以预测患者术后复发风险的标志物：KRAS基因，FBXW7基因，切缘组织突变状态以及新辅助治疗前后肿瘤组织样本分子进化模式。其中切缘组织突变状态和新辅助治疗前后肿瘤组织样本分子进化模式是本专利新发现的标志物，两者均能够有效地区分出高复发风险患者，提示临床及时调整治疗方案，从而使得患者能够得到更长期的生存获益。使得患者能够得到更长期的生存获益。

【技术实现步骤摘要】
局晚期直肠癌术后复发风险相关标记物、评价装置以及计算机可读介质


[0001]本专利技术涉及用于局晚期直肠癌复发风险预测的基因标志物，属于医学分子生物学


技术介绍

[0002]根据世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)发布的2020年全球最新癌症负担数据，结直肠癌位居全球癌症发病率的第三位，而在全球常见癌症死亡率排名中居于第二位，占所有肿瘤新发病例的10％左右。其中直肠癌约占新诊断病例的1/3，部分患者在就诊时已处于局部晚期，失去根治性手术的机会。目前局部晚期直肠癌(LARC，T3
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4NX&TXN1
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2，M0)患者的标准治疗模式为新辅助放化疗
±
直肠癌全系膜切除术
±
辅助化疗。一项针对599例中国LARC患者的多中心随机对照试验中显示，无论采取短程放疗+新辅助化疗或是长程放化疗(CRT)的治疗方案，患者的3年DFS率分别为62.3％和64.5％，仍有一部分患者面临这局部复发或远处转移的风险，严重危害患者的生存。目前临床上主要基于TNM分期将患者患者进行风险分层，但随着二代测序技术的应用，越来越多的相关研究发现根据TNM划分为高低危组中的患者，可以进一步的根据患者术后ctDNA的状态进一步风险分层，提示仅依赖TNM分期的不足，需要更多的风险分层标志物。
[0003]此前已有报道在直肠癌患者的新辅助治疗中，部分患者治疗中检出新发突变，且检出新发突变的患者在未获得pCR组占比更高，暗示新辅助前后突变的变化特征可以提示患者新辅助放化疗疗效，而这种突变图谱的改变对于患者术后复发风险的影响既往未曾有过报道。此外在头颈癌和胰腺癌患者中发现手术切缘组织中检出突变的患者复发风险更高。而目前已有报道FBXW7基因突变以及KRAS基因突变等与LARC患者复发风险相关，但是关于LARC患者基因变异与术后复发风险的报道仍然较少，有待进一步发现。

技术实现思路

[0004]本专利技术通过基因数据的筛选，找到了可以用于评估局晚期直肠癌术后复发风险预测的分子标志物，利用标志物对患者的DFS进行评估时，能够较好地区分术后复发风险的高低。
[0005]用于检测手术切缘组织的基因突变或者新辅助治疗前后肿瘤组织的基因突变的试剂在用于制备直肠癌患者复发风险评估试剂中的应用。
[0006]所述的直肠癌的分型是局晚期。
[0007]所述的基因突变选自单核苷酸变异、插入缺失突变、错义突变、无义突变、剪切突变、移码突变、非移码突变或者启动子突变中的一种。
[0008]所述的基因突变需要满足以下条件：突变丰度≥0.5％或测序深度≥30X，测序得到的reads读数≥2。
[0009]当基因突变是非热点突变时，测序得到的reads读数≥4。
[0010]所述的热点突变是指Cosmic数据库中出现次数≥20次。
[0011]所述的应用中还包括对新辅助治疗前后肿瘤组织中的基因突变是否存在分支进化的判定的步骤。
[0012]复发风险评估是通过无病生存期(DFS)进行评价。
[0013]一种直肠癌患者复发风险评估装置，包括：
[0014]测序模块，用于对样本切缘组织或者肿瘤组织样本进行测序，并获得测序信息；
[0015]判定模块，包括第一判定模块和/或第二判定模块；
[0016]所述的第一判定模块用于手术切缘组织的基因突变情况进行判定，若存在基因突变，则判定样本存在复发风险；
[0017]所述的第二判定模块用于对新辅助治疗前后肿瘤组织的基因突变情况进行判定，若前后存在分支进化，则判定样本存在复发风险。
[0018]一种计算机可读介质，其记载有可运行以下步骤的计算机程序：
[0019]步骤1，获得手术切缘组织的基因突变或者新辅助治疗前后肿瘤组织的基因突变的信息；
[0020]步骤2，对手术切缘组织的基因突变情况进行判定，若存在基因突变，则判定样本存在复发风险；或者，对对新辅助治疗前后肿瘤组织的基因突变情况进行判定，若前后存在分支进化，则判定样本存在复发风险。
[0021]用于检测KRAS或FBXW7基因突变的试剂在用于制备直肠癌患者复发风险评估试剂中的应用。
附图说明
[0022]图1.病理分期对术后复发风险影响。
[0023]图2.淋巴血管侵犯对术后复发风险影响。
[0024]图3.KRAS基因对术后复发风险影响。
[0025]图4.FBXW7基因对术后复发风险影响。
[0026]图5.切缘组织突变状态对术后复发风险影响。
[0027]图6.新辅助治疗前后肿瘤组织进化模式示意图；G1：线性进化；G2：平行进化；G3：分支进化。Trunk：共有突变；Private：各自特有突变。
[0028]图7.新辅助治疗前后肿瘤组织进化模式对术后复发风险影响。
具体实施方式
[0029]本研究中共对55例接受了新辅助放化疗及直肠癌全系膜切除术(TME)的局晚期直肠癌进行了分析，收集患者的活检确诊组织，手术组织以及切缘组织。患者组织DNA样本的提取使用现有商用化试剂盒，提取后的DNA样本采用Qubit 3.0进行纯度评估，而后采用KAPA Hyper Prep Kit进行文库构建，检测覆盖474个关键癌症相关基因的癌症相关panel，具体覆盖基因如下表1所示，测序仪选择Illumina HiSeq 4000。测序完成后通过南京世和基因生物技术股份有限公司生物信息分析流程进行测序数据分析。
[0030]表1 474个关键癌症相关基因
[0031][0032][0033][0034]将临床特征，手术组织中基因突变频率≥10％的基因，切缘组织突变状态及新辅助治疗前后肿瘤组织样本分子进化模式结合随访得到的患者无病生存期(DFS)进行分析，通过Log
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rank进行统计检验，筛选P值<0.05的特征，并进一步通过False Discovery Rate方法进行多重校正，发现KRAS或FBXW7基因为突变型，切缘组织突变阳性或者分支进化(G3)
的患者术后复发风险显著更高(校正P值<0.05)，其中切缘组织突变状态和新辅助治疗前后肿瘤组织样本分子进化模式是新发现的局晚期直肠癌患者术后复发风险预测潜在的分子标志物。
[0035]本专利技术中所述的“基因突变”包含以下几种情况：
[0036]单核苷酸变异(SNV)：单个碱基置换引起，导致编码氨基酸发生变化
[0037]插入缺失突变(Indel)：多个碱基插入或缺失导致编码氨基酸的增加或减少，这些类型的突变可能是“蛋白编码框内的”，导致蛋白质中氨基酸的加入或减少；或导致“移码”，通常导致蛋白质的过早截短。
[0038]错义突变(Missense variants)：DNA碱基置换而引起mRNA上特定的遗传密码的改变，并导致新合成的肽链中氨基酸变化。
[0039]无本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于检测手术切缘组织的基因突变或者新辅助治疗前后肿瘤组织的基因突变的试剂在用于制备直肠癌患者复发风险评估试剂中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的直肠癌的分型是局晚期。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的基因突变选自单核苷酸变异、插入缺失突变、错义突变、无义突变、剪切突变、移码突变、非移码突变或者启动子突变中的一种。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的基因突变需要满足以下条件：突变丰度≥0.5％或测序深度≥30X，测序得到的reads读数≥2。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，当基因突变是非热点突变时，测序得到的reads读数≥4。6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的热点突变是指Cosmic数据库中出现次数≥20次。7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的应用中还包括对新辅助治疗前后肿瘤组织中的基因突变是否存在分支进化的判定的步骤。8...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁双虎，于金明，邵阳，贺科文，李莉，李爱杰，逄娇慧，徐洋，吴晓英，
申请(专利权)人：南京世和基因生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：