一种可合成瓦伦烯的工程藻株及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种可合成瓦伦烯的工程藻及其制备方法，通过以PCC6803为底盘藻，导入法尼基焦磷酸合酶基因表达框、异戊烯焦磷酸异构酶基因表达框和1脱氧

【技术实现步骤摘要】
一种可合成瓦伦烯的工程藻株及其制备方法


[0001]本专利技术属于基因工程及生物工程领域，具体涉及一种可合成瓦伦烯的工程藻株及其制备方法。

技术介绍

[0002]瓦伦烯属于萜烯化合物，天然存在于柑橘类水果中，由于具有甜橙油特征香气因此常用作香料。瓦伦烯目前主要通过蒸馏、萃取等工艺从柑橘精油中获得，过程繁琐且高耗。以微藻和光合细菌等光自养微生物为底盘，应用合成生物技术开发高效光合细胞工厂，通过光能驱动二氧化碳向萜类物质直接转化，为萜类物质提供了一条简洁、绿色、高效的合成路线。2020年，研究人员成功在集胞藻PCC6803中实现了从CO2到瓦伦烯的生物合成，这也是所能找到的应用蓝细菌为底盘生产瓦伦烯的唯一一篇报道。首先通过过表达来自C.nootkatensis的瓦伦烯合酶及大肠杆菌来源的法尼基焦磷酸合酶基因ispA，在摇床条件下培养166h后产量达到9.6mg/L，产率为1.38mg/L/Day，但该研究缺少系统的代谢优化，且藻株在长时间培养中的生长、产率、遗传稳定性等性能都缺乏量化评价，因此该瓦伦烯细胞工厂在实际应用时并不具有优势。(Matsudaira,A.,et al.,Production of glutamate and stereospecific flavors,(S)
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linalool and(+)
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valencene,by Synechocystis sp.PCC6803.J Biosci Bioeng,2020.130(5):p.464
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470)。

技术实现思路

[0003]本专利技术以蓝细菌集胞藻PCC6803为底盘藻，进行了一系列改进，得到了能够大量合成瓦伦烯的工程藻株。
[0004]基于以上研究，本专利技术提供了一种制备可合成瓦伦烯的工程藻的方法，包括以PCC6803为底盘藻，向所述底盘藻中导入法尼基焦磷酸合酶基因表达框、异戊烯焦磷酸异构酶基因表达框和1脱氧
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D
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木酮糖
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磷酸合酶基因表达框中的一种或多种，并导入瓦伦烯合酶基因表达框。
[0005]在一个具体实施方案中，所述底盘蓝细菌选自聚球藻、集胞藻、鱼腥藻。优选地，所述底盘蓝细菌选自聚球藻PCC7942、集胞藻PCC6803、聚球藻UTEX2973、鱼腥藻PCC 7120、聚球藻PCC7002。
[0006]在一个具体实施方案中，所述法尼基焦磷酸合酶基因表达框中，法尼基焦磷酸合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0007]在一个具体实施方案中，，所述异戊烯焦磷酸异构酶基因表达框中，异戊烯焦磷酸异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0008]在一个具体实施方案中，所述1脱氧
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木酮糖
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磷酸合酶基因表达框中，1脱氧
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木酮糖
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磷酸合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
[0009]在一个具体实施方案中，所述瓦伦烯合酶基因表达框中，瓦伦烯合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
[0010]本专利技术还提供了上述方法制备得到的可合成瓦伦烯的工程藻。
[0011]本专利技术还提供了一种生产瓦伦烯的方法，包括以下步骤：
[0012]S1：将权利要求6所述的工程藻接种至光反应器中；
[0013]S2：向所述光反应器中加入用于收集瓦伦烯的溶剂；
[0014]S3：培养所述工程藻，定期收集加入到所述光反应器中的溶剂，并重新添加等量的所述溶剂，收集的所述溶剂中即含有瓦伦烯。
[0015]在一个具体实施方案中，所述溶剂为十二烷。
[0016]在一个具体实施方案中，S3中，每三天收集和添加所述溶剂。
[0017]在一个具体实施方案中，培养至第6天后每3
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4天取出50％的藻液，并加入等量的新鲜培养基。
[0018]本专利技术通过代谢途径重构手段，向底盘藻PCC6803中导入法尼基焦磷酸合酶基因表达框、异戊烯焦磷酸异构酶基因表达框和1脱氧
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磷酸合酶基因表达框，并导入瓦伦烯合酶基因表达框。该方案提高了瓦伦烯生物合成的效率，工程藻株在培养前3天瓦伦烯产量最高达到7.58mg/L/Day，较目前已知蓝细菌合成瓦伦烯产量的最高报道提高了5.4倍。在此基础上，通过培养策略优化，将藻株的生产周期延长至36天，总产量为154.81mg/L，产率达到4.3mg/L/Day。
附图说明
[0019]图1为重组质粒pJS50、pJS51、pJS53、pJS54的结构示意图。
[0020]图2为重组质粒pJS78、pJS79的结构示意图。
[0021]图3为各工程藻株在中性位点Slr0168和Slr9394处的扩增产物的电泳照片。
[0022]图4为瓦伦烯的标准品和样品的GC
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MS峰图。
[0023]图5为各工程藻株生产瓦伦烯的统计图。
[0024]图6为JS133在优化条件前后的生长曲线(左)和瓦伦烯总产量曲线(右)。
具体实施方式
[0025]以下结合附图对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。
[0026]1.所用到的藻株
[0027]本专利技术所用的底盘藻为集胞藻PCC6803，该藻株常被作为模式菌株进行相关的实验研究。
[0028]2.质粒构建
[0029]法尼基焦磷酸合酶(IspA，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，核酸序列如SEQ ID NO:2所示)来自E.coli MG1655，异戊烯焦磷酸异构酶(Idi，氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，核酸序列如SEQ ID NO:4所示)来自S.cerevisiaeBY4741，1脱氧
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木酮糖
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磷酸合酶(Dxs，氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，核酸序列如SEQ ID NO:6所示)来自E.coli MG1655。
[0030]将基因idi
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ispA串接在启动子P
cpcB560
的下游构成Idi
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IspA表达框，将基因dxs片段接在启动子P
rbcL6803
的下游构成Dxs表达框，将两个表达框串接在一起得到Idi
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IspA
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Dxs表达框，然后将IspA表达框/Idi表达框/Idi
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IspA表达框/Idi
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IspA
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Dxs表达框分别插入到
中性位点Slr9394的上下游同源臂之间，以卡那霉素抗性为筛选标记，将上述片段插入到pUC19骨架上，分本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备可合成瓦伦烯的工程藻的方法，其特征在于，包括向底盘蓝细菌中导入法尼基焦磷酸合酶基因表达框、异戊烯焦磷酸异构酶基因表达框和1脱氧
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磷酸合酶基因表达框中的一种或多种，并导入瓦伦烯合酶基因表达框。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述法尼基焦磷酸合酶基因表达框中，法尼基焦磷酸合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述异戊烯焦磷酸异构酶基因表达框中，异戊烯焦磷酸异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述1脱氧
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木酮糖
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磷酸合酶基因表达框中，1脱氧
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磷酸合酶的...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕雪峰，孙佳慧，栾国栋，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：