四种抗凝剂的HPLC检测方法技术

本发明专利技术属于生物化学检测领域，具体涉及四种抗凝剂的HPLC检测方法。本发明专利技术公开了一种蛋白缓冲液中快速进行抗凝剂检测的HPLC方法，所述抗凝剂包括柠檬酸钠、草酸钠、肝素钠和EDTA.2Na。本发明专利技术的HPLC检测方法，可以对抗凝剂定性检测，并且可对柠檬酸钠和EDTA.2Na定量。该方法专属性强、简便、快速、精确、分离度较好，测定结果准确可靠，可以快速判定抗凝剂的类型，具有良好的应用前景。具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
四种抗凝剂的HPLC检测方法


[0001]本专利技术属于生物化学检测领域，具体涉及四种抗凝剂的HPLC检测方法。

技术介绍

[0002]抗凝剂主要是用物理或化学方法，除掉或抑制血液中的某些凝血因子，阻止血液凝固，达到抗凝血目的，可分为柠檬酸盐、草酸盐、肝素和EDTA四种。其中柠檬酸盐、EDTA均可通过于钙离子结合，形成螯合物，从而阻止血液凝固；草酸盐可通过于钙离子结合，形成沉淀，从而阻止血液凝固；而肝素可加强抗凝血酶III(AT
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III)灭活丝氨酸蛋白酶，从而具有阻止凝血酶的形成。抗凝剂除被用作抗凝剂之外，还是常用试剂之一，被应用于生物、化学中主要用作络合性剂、缓冲剂之类。在蛋白缓冲液常会添加一些抗凝剂用做络合性剂，去除一些金属离子，防止金属离子破环蛋白的结构及活性，保持蛋白的稳定性。
[0003]柠檬酸盐的GB和药典检测方法有化学检测法和HPLC检测，其中HPLC检测有离子交换法和反相法；草酸盐GB和药典检测方法主要是化学检测法和反相HPLC检测；肝素药典检测方法有阴离子交换色谱柱，EDTA检测方法GB和药典检测方法有化学检测法和反相HPLC检测，但是这些检测方法都是针对专一一种抗凝剂类型的检测，尚无一种方法能满足同时检测四种类型的抗凝剂，并且对于生物行业，抗凝剂被作于络合剂用于蛋白缓冲液中，成分较为复杂，快速而准确的检测方法更为需要。因此，寻求一种能够有效分离且快速检出蛋白缓冲液抗凝剂方法，对样品进一步质量控制具有十分重要的意义。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供四种抗凝剂的HPLC检测方法。
[0005]本专利技术提供了抗凝剂的HPLC检测方法，其包括：将样品经过滤后，采用HPLC进行检测：
[0006]所述HPLC的检测条件包括：
[0007]流动相A：pH值为2～3的磷酸水溶液；
[0008]流动相B：甲醇；
[0009]洗脱程序为：
[0010]第0～20min，流动相A的体积分数为99％至90％；
[0011]第20～25min，流动相A的体积分数为90％至10％；
[0012]第25～35min，流动相A的体积分数为10％；
[0013]第35～40min，流动相A的体积分数为10％至99％；
[0014]第40～50min，流动相A的体积分数为99％。
[0015]进一步的，所述的HPLC检测方法中，
[0016]流动相A为pH值为2.15的磷酸水溶液；
[0017]色谱柱为Agilent Inertsil ODS
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SP C18色谱柱，所述Agilent Inertsil ODS
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SP C18色谱柱长度为4.6mm，内径为250mm，填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，填充剂粒径为5μ
m；
[0018]进样体积为5μL，柱温为30℃、流速为1.0ml/min。
[0019]检测波长为210nm。
[0020]本专利技术中，所述色谱柱在进样前需要利用磷酸溶液调节柱体pH至2.15。
[0021]本专利技术中，所述抗凝剂包括柠檬酸钠、草酸钠、肝素钠和EDTA.2Na。
[0022]本专利技术中，所述的HPLC检测方法分离得到的四种抗凝剂出峰时间均不同，具有较强专属性；同时本专利技术所述的HPLC检测方法可规避不同蛋白缓冲体系、不同蛋白稳定剂、不同缓冲体系蛋白的影响，稳定的实现四种抗凝剂的快速检测，检测结果精确、分离度较好，具有良好的应用前景。
[0023]本专利技术中，所述蛋白稳定剂包括表面活性剂和抗氧化剂。所述的表面活性剂包括阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂和非离子去污剂；所述阳离子表面活性剂包括但不限于S8和/或苯扎溴铵；所述阴离子表面活性剂包括但不限于SDS；所述非离子去污剂包括但不限于Triton。所述抗氧化剂包括但不限于DTT和或β
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巯基乙醇。
[0024]在本专利技术提供的方法具有良好的抗干扰能力，实验表明，0.1％ SDS、1％Triton x
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100、0.1％ S8或5mM DTT的存在，皆不影响四种免疫抑制剂的检测。
[0025]本专利技术不同缓冲体系蛋白中，所述蛋白包括但不限于BSA或其他包含在检测样品中的蛋白，本专利技术对此不做限定。在本专利技术的一些具体实施例中，2％BSA的存在不影响四种免疫抑制剂的检测。
[0026]本专利技术中，所述的缓冲体系包括但不限于PBS缓冲体系、Tris缓冲体系和KCl缓冲体系。本专利技术的一些具体实施例中，20mM Tris、10mM PBS或10mM KCl的存在不影响四种免疫抑制剂的检测。
[0027]本专利技术中，所述HPLC检测方法还包括标准品溶液的配制：将柠檬酸钠、草酸钠、肝素钠和EDTA.2Na试剂，溶解于水获得标准品溶液。
[0028]本专利技术中，所述HPLC检测方法中抗凝剂含量的计算方式为：
[0029]采用高效液相色谱法，在相同的检测条件下分别获得样品和标准品溶液中的抗凝剂的色谱图；
[0030]根据所述标准品溶液中抗凝剂的浓度、所述标准品在色谱图中的峰面积以及样品中与标准品相对应的成分在色谱图中的峰面积，且基于本专利技术所述的检测方法，以外标两点法计算抗凝剂的含量。
[0031]本专利技术所述的HPLC检测方法中，所述抗凝剂的线性范围包括：
[0032]柠檬酸钠线性范围为0.1mM～10mM；
[0033]EDTA.2Na线性范围为0.03mM～0.7mM；
[0034]草酸钠线性范围为0.04mM～80mM；
[0035]肝素钠线性范围为0.04mg/ml～1mg/ml。
[0036]本专利技术所述的HPLC检测方法线性范围广、准确高，在一些具体的实施例中，所述柠檬酸钠线性范围为0.1mM～10mM，定量限0.08mM(信噪比10:1)，检测限0.05mM(信噪比3:1)；所述EDTA.2Na线性范围为0.03mM～0.7mM，定量限0.02mM(信噪比10:1)，检测限0.01mM(信噪比3:1)；所述草酸钠线性范围为0.04mM～80mM，定量限0.01mM(信噪比10:1)，检测限0.004mM(信噪比3:1)；所述肝素钠线性范围为0.04mg/ml～1mg/ml，定量限0.02mg/ml(信噪
比10:1)，检测限0.014mM(信噪比3:1)。
[0037]本专利技术所述的HPLC检测方法重复性强、精密度高。
[0038]一些具体的实施例中，5mM柠檬酸钠、0.4mM EDTA.2Na、0.4mM草酸钠、0.5mM肝素钠均重复6次，其检测相对标准偏差RSD分别为0.35％、0.63％、0.38％、0.1％，证明所述的HPLC检测方法重复性良好。
[0039]另一些具体的实施例中，3.4mM柠檬酸钠、0.3mM EDTA.2Na、1M草酸钠、0.7mg/ml肝素钠均重复检测6次，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.抗凝剂的HPLC检测方法，其特征在于，将样品经过滤后，采用HPLC进行检测：所述HPLC的检测条件包括：流动相A：pH值为2～3的磷酸水溶液；流动相B：甲醇；洗脱程序为：第0～20min，流动相A的体积分数为99％至90％；第20～25min，流动相A的体积分数为90％至10％；第25～35min，流动相A的体积分数为10％；第35～40min，流动相A的体积分数为10％至99％；第40～50min，流动相A的体积分数为99％。2.根据权利要求1所述的HPLC检测方法，其特征在于，所述流动相A为pH值为2.15的磷酸水溶液。3.根据权利要求1所述的HPLC检测方法，其特征在于，所述HPLC的色谱柱为Agilent Inertsil ODS
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SP C18色谱柱；所述Agilent Inertsil ODS
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SP C18色谱柱长度为4.6mm，内径为250mm，填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶，填充剂粒径为5μm。4.根据权利要求1所述的HPLC检测方法，其特征在于，所述HPLC检测方法的进样体积为5μL，柱温为30℃、流速为1.0ml/min。5.根据权利要求1所述的HPLC检...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘小方，徐延伟，王贝贝，张春鸽，赵巧辉，李桂林，付光宇，杨增利，
申请(专利权)人：郑州伊美诺生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：