基于环介导等温扩增技术检测狼牙病毒的引物及应用制造技术

本发明专利技术提供了一种用于检测狼牙病毒的LAMP引物组，所述LAMP引物组包括LayV1

【技术实现步骤摘要】
基于环介导等温扩增技术检测狼牙病毒的引物及应用


[0001]本专利技术涉及分子检测
，具体涉及一种基于环介导等温扩增技术检测狼牙病毒的引物及应用。

技术介绍

[0002]狼牙亨尼帕病毒(英文名：Langya henipavirus，LayV)属于副黏病毒科亨尼帕病毒属，一种可感染人类的新的动物源性亨尼帕病毒(henipavirus)。其基因组由18402个核苷酸组成，基因组结构与其他亨尼帕病毒相同。在蝙蝠、老鼠和鼩身上也发现了其他几种亨尼帕病毒，但已知只有亨德拉、尼帕和现在的狼牙病毒会感染人类。狼牙病毒感染的症状包括发烧、咳嗽、疲劳、食欲不振、肌肉疼痛、恶心和呕吐等症状，伴有白细胞减少症和血小板减少症，以及肾功能和肝功能受损等异常现象。
[0003]环介导恒温扩增(LAMP，Loop
‑
madiated isothermal amplification)是近年兴起并逐步应用于各种病原体检测的一种新颖的核酸检测技术。LAMP技术的反应原理为：根据目的基因设计的6条引物靶向性识别目的基因上的六个独立片段，在Bst大片段聚合酶的作用下进行扩增反应，大量扩增目标片段的同时也产生了沉淀，反应管浊度发生了变化，可通过实时浊度来判断反应结果。
[0004]LAMP技术较常规PCR具有更高的特异性。因为不需要预先的双链DNA热变性，避免了温度循环而造成的时间损失，可实现短时间内核酸大量扩增。在恒温条件下反应，不需要昂贵和复杂的热循环器设备，只需要一个简单的恒温器(如水浴锅、金属浴)即可完成反应。LAMP产物的检测可以通过简单的琼脂糖凝胶电泳，使用荧光染料如SYBR GREEN，肉眼观察浊度或使用浊度计来监测焦磷酸镁的沉淀来实现，为基础实验室以及条件相对匮乏的实验环境提供了实现分子检测的可能性。相对于常规的qPCR技术，LAMP技术更能满足快速诊断的要求。
[0005]目前的检测方法所需时间较长，样品如咽拭子、血液等需经核酸提取后再进行检测，对于单个样本的处理往往耗较久，需要对大量样本进行处理时，也增加了样本之间相互污染的几率。
[0006]LAMP使用多种引物增加了引物
‑
引物杂交的风险，导致无模板扩增，导致假阳性结果。在搭配保存液进行直扩时，这种特异性扩增会被放大，同时还会损失灵敏度。
[0007]因此，我们针对狼牙病毒核酸的一段特异基因序列，专利技术了一种试剂盒，采用免提取的方法对样本进行扩增，并不会对扩增带来影响，能够快速、特异地完成检测。

技术实现思路

[0008]本专利技术的术语和声明：
[0009]本专利技术中，术语“引物”是指在核苷酸聚合作用起始时，刺激合成的一种具有特定核苷酸序列的大分子，与反应物以氢键形式连接。引物通常是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与靶区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与靶区域另一端的另一条
DNA模板链互补，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3'端开始合成新的核酸链。
[0010]本专利技术的目的是提供一种检测狼牙病毒的LAMP引物组，样本免提取，检测的灵敏度高、特异性强。
[0011]本专利技术技术方案包括：
[0012]第一方面，本专利技术提供了一种用于检测狼牙病毒的LAMP引物组，所述LAMP引物组包括LayV1
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F3、LayV1
‑
B3、LayV1
‑
FIP、LayV1
‑
BIP、LayV1
‑
LF和LayV1
‑
LB；
[0013]所述LayV1
‑
F3的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
[0014]所述LayV1
‑
B3的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
[0015]所述LayV1
‑
FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
[0016]所述LayV1
‑
BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
[0017]所述LayV1
‑
LF的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
[0018]所述LayV1
‑
LB的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
[0019]第二方面，本专利技术提供了一种用于狼牙病毒检测的试剂盒，所述试剂盒包含上述的LAMP引物组。
[0020]优选地，所述试剂盒中还包括缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、逆转录酶、dUTP、尿嘧啶DNA糖苷酶和荧光染料。
[0021]进一步优选地，所述试剂盒还包括Mg
2+
。
[0022]进一步优选地，所述缓冲液选自Tris
‑
HCl、(NH4)2SO4、KCl、曲拉通X
‑
100、SDS、甜菜碱、PEG2000中的至少一种。
[0023]更进一步优选地，所述Tris
‑
HCl的浓度为100
‑
500mM；
[0024]最优选地，所述Tris
‑
HCl的浓度为300mM。
[0025]更进一步优选地，所述(NH4)2SO4的浓度为20
‑
200mM；
[0026]更进一步优选地，所述(NH4)2SO4的浓度为50
‑
150mM；
[0027]最优选地，所述(NH4)2SO4的浓度为100mM。
[0028]更进一步优选地，所述KCl的浓度为50
‑
200mM；
[0029]更进一步优选地，所述KCl的浓度为80
‑
150mM；
[0030]最优选地，所述KCl的浓度为100mM。
[0031]更进一步优选地，所述曲拉通X
‑
100的浓度为0.2
‑
2％(v/v)；
[0032]更进一步优选地，所述曲拉通X
‑
100的浓度为0.5
‑
1.5％(v/v)；
[0033]最优选地，所述曲拉通X
‑
100的浓度为1％(v/v)。
[0034]更进一步优选地，所述SDS的浓度为0.01
‑
0.1％(w/v)；
[0035]更进一步优选地，所述SDS的浓度为0.03
‑
0.08％(w/v)；
[0036]最优选地，所述SDS的浓度为0.05％(w/v)。
[0037]更进一步优选地，所述甜菜碱的浓度为2
‑
15M；
[0038]更进一步优选地，所述甜菜碱的浓度为5
‑
10M；
[0039]最优选地，所述甜菜碱的浓度为8M。
[0040]更进一步优选地，所述PEG2000的浓度为1
‑
5％(v/v)；
[0041]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测狼牙病毒的LAMP引物组，其特征在于，所述LAMP引物组包括LayV1
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F3、LayV1
‑
B3、LayV1
‑
FIP、LayV1
‑
BIP、LayV1
‑
LF和LayV1
‑
LB；所述LayV1
‑
F3的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述LayV1
‑
B3的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述LayV1
‑
FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述LayV1
‑
BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述LayV1
‑
LF的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述LayV1
‑
LB的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。2.一种用于狼牙病毒检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的LAMP引物组。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、逆转录酶、dUTP、尿嘧啶DNA糖苷酶和荧光染料。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液选自Tri...

【专利技术属性】
技术研发人员：周娟，纪博知，王频艺，刘佳，戴立忠，
申请(专利权)人：圣湘生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：