本发明专利技术公开了一种弓形虫基因敲除虫株，该虫株缺失核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的弓形虫致密颗粒家族蛋白基因(TGME49_299780基因)，本发明专利技术还公开了该虫株的构建方法，属于生物及基因工程领域。本发明专利技术构建的基因敲除虫株ME49Δ299780具有毒力小，在动物体内繁殖少等优点，能提高动物对弓形虫的免疫能力，有成为抗弓形虫基因工程疫苗的潜力。抗弓形虫基因工程疫苗的潜力。抗弓形虫基因工程疫苗的潜力。
【技术实现步骤摘要】
弓形虫TGME49_299780基因敲除虫株的构建方法及应用
[0001]本专利技术涉及弓形虫基因敲除虫株，尤其是一种弓形虫TGME49_299780基因敲除虫株，经鉴定，该基因编码的蛋白属于弓形虫致密颗粒家族蛋白，本专利技术还涉及敲除虫株的构建方法及其用途，属于生物及基因工程领域。
技术介绍
[0002]刚地弓形虫(简称弓形虫)作为一种细胞内专性寄生原虫，拥有复杂的生活史，其中间宿主十分广泛但终末宿主单一，是研究顶复门原虫的经典模式生物。由弓形虫感染引起的弓形虫病可以在包括人类在内的多个物种间传播，弓形虫病的流行病学调查结果显示，弓形虫病呈全球性广泛分布，在免疫功能正常的感染者体内一般不表现明显的临床症状，主要的危害群体为免疫缺陷者或处于妊娠期者，处于妊娠期的患者主要临床症状表现为流产、死胎，严重损害畜牧业经济发展的同时还引发了严重的公共卫生安全问题，因此，加强对弓形虫病的防控对于人类健康和畜牧养殖业的发展均有重要意义。
[0003]目前，药物治疗对弓形虫病的防控具有局限性，乙胺嘧啶和磺胺嘧啶等针对叶酸代谢途径的抑制剂对弓形虫速殖子有效，但被弓形虫感染后大多数个体都表现为无临床症状的慢性感染，大量弓形虫在宿主体内以缓殖子的形式存在，使用药物无法达到有效的治疗效果，因而构建具有良好免疫原性和免疫保护力的弓形虫疫苗具有重要价值。近年来，CRISPR/Cas9技术被广泛应用于弓形虫基因编辑，为弓形虫疫苗的开发提供了有力的支持。
[0004]致密颗粒家族蛋白(GRAs)是弓形虫重要的分泌蛋白，在纳虫泡形成的同时，GRAs以类似胞吐作用的形式被连续释放至纳虫泡空间和纳虫泡膜上发挥功能，还有少数的GRAs靶向宿主细胞核发挥功能。目前研究发现，GRAs是纳虫泡的重要组成部分，对修饰纳虫泡、促进纳虫泡的成熟和进一步发育为组织包囊至关重要，并在弓形虫获取能量完成寄生生活、躲避宿主免疫系统的攻击等方面发挥着重要的作用。
技术实现思路
[0005]本专利技术的目的是提供一种弓形虫TGME49_299780基因敲除虫株及其构建方法，本专利技术鉴定了TGME49_299780基因编码的蛋白属于弓形虫致密颗粒家族蛋白，所构建的虫株由于敲除了TGME49_299780基因导致其编码蛋白的功能缺失，具有毒力低，在动物体内繁殖量少等优点，相比野生型虫株能为动物提供更好的抵抗弓形虫感染的免疫能力，有制备抗弓形虫基因工程疫苗的潜力。
[0006]为实现上述目的，申请人首先以弓形虫RHΔku80虫株为出发虫株，构建了一种弓形虫蛋白定位虫株(简称299780
‑3×
HA虫株)，通过间接免疫荧光试验，发现299780蛋白可以与已知的弓形虫致密颗粒蛋白GRA7共定位，由此证明了299780蛋白属于弓形虫致密颗粒家族。
[0007]接着，申请人使用CRISPR/Cas9技术对出发虫株ME49进行基因敲除，敲除虫株的构建方法包括构建pSAG1
‑
Cas9
‑
TgU6
‑
sg299780质粒、制备α
‑
299780
‑
5UTR::DHFR::α
‑
299780
‑
3UTR同源模板，共同电转至出发虫株ME49并进行乙胺嘧啶筛选、PCR鉴定等步骤，最终获得弓形虫基因敲除虫株ME49Δ299780。具体的构建方法如下：
[0008](1)以pSAG1
‑
Cas9
‑
TgU6
‑
sgUPRT质粒为模板，设计TGME49_299780基因的打靶位点，根据打靶位点设计引物进行定点突变，将上述模板质粒中的sgUPRT替换为TGME49_299780基因靶点特异的gRNA，构建pSAG1
‑
Cas9
‑
TgU6
‑
sg299780质粒；
[0009](2)以出发虫株的基因组为模板，设计引物，分别扩增TGME49_299780基因上下游同源臂，构建包含TGME49_299780基因上下游同源臂的同源重组模板；
[0010](3)将步骤(1)构建的pSAG1
‑
Cas9
‑
TgU6
‑
sg299780质粒和步骤(2)构建的同源重组模板共电转至出发虫株，经药物筛选、PCR鉴定获得弓形虫TGME49_299780基因缺失虫株。
[0011]其中，所述TGME49_299780基因打靶位点的序列如SEQ ID NO：2所示，根据该打靶位点设计的引物序列如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示。
[0012]其中，所述TGME49_299780基因上下游同源臂的引物序列为：
[0013]U5α
‑
299780
‑
F：如SEQ ID NO：5所示；
[0014]U5α
‑
299780
‑
R：如SEQ ID NO：6所示；
[0015]U3α
‑
299780
‑
F：如SEQ ID NO：7所示；
[0016]U3α
‑
299780
‑
R：如SEQ ID NO：8所示。
[0017]其中，所述同源重组模板的载体质粒是pUC19，模板中还含有DHFR*药物筛选标签。
[0018]接着，利用构建的基因敲除虫株ME49Δ299780开展以下试验：
[0019](1)进行了基因敲除虫株ME49Δ299780的毒力试验：以野生型虫株ME49为对照，腹腔接种1
×
102个速殖子/小鼠至6周龄的雌性ICR小鼠体内，每组10只小鼠，记录30天内小鼠的存活情况。结果表明感染ME49Δ299780敲除株的小鼠30天内存活率为100％，而接种野生型ME49的小鼠30天内有60％死亡，说明ME49Δ299780敲除株的毒力远低于出发虫株。
[0020](2)小鼠感染ME49Δ299780虫株后的荷虫量试验：对6周龄的雌性ICR小鼠腹腔接种1
×
104个ME49Δ299780敲除株或ME49野生型虫株速殖子，感染7天后，收取小鼠腹水，进行定量qPCR，分析腹水中的荷虫量。结果显示接种ME49Δ299780敲除虫株的小鼠腹水荷虫量显著低于野生型ME49的对照组小鼠腹水荷虫量，说明弓形虫ME49Δ299780在小鼠体内繁殖能力降低。
[0021](3)ME49Δ299780虫株对小鼠的免疫保护力：以1
×
102个ME49Δ299780虫株速殖子/小鼠的感染量接种10只6周龄的ICR雌鼠。在第30天后对免疫过的小鼠及空白ICR小鼠分别接种1
×
104个ME49或RH野生型虫株，观察、记录小鼠死亡情况，统计小鼠30天内的死亡率。结果表明ME49Δ299780虫株对小鼠抵抗野生型虫株感染具有良好的保护本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种弓形虫基因敲除虫株，其特征在于：该虫株被敲除了核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的弓形虫致密颗粒家族蛋白基因(TGME49_299780基因)。2.一种构建权利要求1所述弓形虫基因敲除虫株的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)以pSAG1
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Cas9
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TgU6
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sgUPRT质粒为模板，设计TGME49_299780基因的打靶位点，根据打靶位点设计引物进行定点突变，将上述模板质粒中的sgUPRT替换为TGME49_299780基因靶点特异的gRNA，构建pSAG1
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Cas9
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TgU6
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sg299780质粒；(2)以出发虫株的基因组为模板，设计引物，分别扩增TGME49_299780基因上下游同源臂，构建包含TGME49_299780基因上下游同源臂的同源重组模板；(3)将步骤(1)构建的pSAG1
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Cas9
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TgU6
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sg299780质粒和步骤(2)构建的同源重组模板共电转至出发虫株，经药物筛选、PCR鉴定获得弓形虫TGME49_299780基因敲除虫株。3.如权利要求2所述弓形虫基因敲除虫株的构建方法，其特征在于：所述TGME49_299780基因打靶位点的序列如SEQ ...
【专利技术属性】
技术研发人员：方瑞，何明凤，赵俊龙，申邦，周艳琴，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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