一种重组抗原复合物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其涉及一种重组抗原复合物及其制备方法和应用。该重组抗原复合物为CFP

【技术实现步骤摘要】
一种重组抗原复合物及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种重组抗原复合物及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]结核分枝杆菌感染的诊断方法主要有影像学、血清学、细菌培养、核酸检测及T细胞免疫检测，影像学、血清学检测的灵敏度和特异性有待提高，细菌培养为结核诊断的金标准但是培养周期长、阳性率低。
[0003]T细胞免疫检测是结核分枝杆菌检测的常用手段，其主要原理是依据是初次感染后，T淋巴细胞主要分化为效应T细胞和记忆T细胞，当记忆T细胞再次接受抗原呈递细胞(APC)递呈上来的相同抗原刺激时能够快速增殖，并分泌细胞因子，通过对细胞因子的检测能间接的判断是否存在感染。目前市场上存在两类试剂盒，一类是以T
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SPOT为代表，检测外周血单核细胞(PBMC)；一类是大部分厂家(Quanti
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FERON Gold；万泰；安图生物等)检测全血细胞。T细胞免疫检测的核心是特异性刺激抗原，目前各个厂家所用的主要抗原为结核分枝杆菌基因组RD1区编码的结核特异性抗原早期分泌性抗原靶
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6(ESAT
‑
6)和培养滤液蛋白
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10(CFP
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10)，这两个抗原为结核分枝杆菌所特有，T
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spot和QFT采用多肽作为刺激抗原，万泰和安图等国内厂家采用重组抗原作为刺激抗原。重组刺激抗原因成本低、表位全面在结核特异性T淋巴细胞免疫检测中有较大的优势。
[0004]刺激抗原灵敏度和特异性影响因素有蛋白的纯度、内毒素含量、抗原表位暴露情况等，通常特异性刺激抗原的制备方法是将ESAT
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6和CFP
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10分别表达、纯化、去除内毒素，单抗原的纯化周期接近2周时间，另外由于分子量较小的缘故ESAT
‑
6和CFP
‑
10的表达量同样较低，给抗原制备带来了较大的困难及成本，添加融合标签表达能够显著提升表达量，但同样会引入非特异性因素，抗原制备后还需要按照比例进行添加，操作较为复杂，批间差不易控制。有研究者采用嵌合抗原(融合蛋白)进行制备(Philip C.Hill，et al.，2005，CN 103122033)，但是嵌合抗原对抗原的结构改变较大，会造成部分检测低值或者漏检，Philip C.Hill在对CFP10
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ESAT6融合蛋白和多肽进行刺激效果对比时，所有188例阳性检出中，有20例(10.6％)为多肽独自检出，27例(14.4％)为融合蛋白独自检出，在我们先前的实验中也验证到CFP10
‑
ESAT6融合蛋白很难达到两个单独抗原的反应水平，这可能与融合蛋白造成了部分检测表位的丢失导致，专利CN 103122033中融合蛋白除ESAT6和CFP10外又加入了TB7.7抗原做为补充，且未进行单独抗原的对比验证，且改变了蛋白N端的主要的T细胞表位。
[0005]ESAT
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6和CFP
‑
10可以形成1:1紧密的复合体(Brodin P.et al.，2005)，与T细胞免疫反应和毒力有关，传统的刺激抗原制备过程多采用两个抗原分别表达、纯化和使用，除表达量低缺点外还不能形成天然构象的蛋白，同时因ESAT6疏水性强，蛋白保存极不稳定，融合蛋白虽然能够克服表达量低、蛋白不稳定的缺点，但是影响了部分表位的展示，灵敏度达不到单个抗原组合的水平。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术提供了一种重组抗原复合物及其制备方法和应用。该抗原复合物克服了传统特异性T细胞刺激抗原制备过程中的表达量低或反应性弱的缺点，且制备方法简单，适用于用于结核感染细胞免疫检测。
[0007]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0008]一种重组抗原复合物，其为CFP
‑
10蛋白或和ESAT
‑
6蛋白形成的异源二聚体蛋白；所述ESAT
‑
6蛋白为全长或其截短片段；所述CFP
‑
10蛋白为全长或其截短片段。
[0009]一些实施方案中，所述ESAT
‑
6蛋白为ESAT
‑
6蛋白全长，具体序列如SEQ ID NO:1所示。所述CFP
‑
10蛋白为蛋白全长，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0010]本专利技术中，所述CFP
‑
10蛋白和ESAT
‑
6蛋白的摩尔比为1:1。一些具体实施例中，所述CFP
‑
10蛋白和ESAT
‑
6蛋白的摩尔比为1:1。
[0011]本专利技术所述的抗体组合物由前体重组蛋白ESAT
‑6‑
CFP
‑
10经原核表达、酶切获得；
[0012]所述前体重组蛋白ESAT
‑6‑
CFP
‑
10由N端到C端包括：ESAT
‑
6蛋白和CFP
‑
10蛋白，两蛋白通过可裂解的连接肽相连；
[0013]所述ESAT
‑
6蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述CFP
‑
10蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0014]本专利技术中，前体重组蛋白ESAT
‑6‑
CFP
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10在其N末端不具有任何标签或者氨基酸，在其C末端添加纯化标签。前体重组蛋白ESAT
‑6‑
CFP
‑
10的序列具体为：ESAT
‑
6蛋白(SEQ ID NO:1所示)
‑
连接肽
‑
CFP
‑
10蛋白(SEQ ID NO:2所示)
‑
纯化标签。
[0015]一些实施方案中，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示：GLVPRGS。
[0016]本专利技术对前体重组蛋白ESAT
‑6‑
CFP
‑
10C末端的纯化标签不作具体限定，本领域常用的均可，本专利技术的具体实施例中，纯化标签为6
×
His标签，位于CFP
‑
10蛋白的C末端。
[0017]本专利技术还提供了编码前体重组蛋白CFP
‑
10
‑
ESAT
‑
6的核酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0018]本专利技术还提供了包含所述核酸的重组载体。
[0019]本专利技术提供一种所述抗原复合物的制备方法，包括：
[0020]将所述的重组表达载体转化宿主细胞，诱导蛋白表达；
[0021]裂解细胞、纯化后，用蛋白酶进行酶切处理；将所述酶切产物4℃孵育12小时，获得所述抗原复合物。
[0022本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组抗原复合物，其特征在于，其为CFP
‑
10蛋白或和ESAT
‑
6蛋白形成的异源二聚体蛋白；所述ESAT
‑
6蛋白为全长或其截短片段；所述CFP
‑
10蛋白为全长或其截短片段。2.根据权利要求1所述的重组抗原复合物，其特征在于，所述ESAT
‑
6蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。3.根据权利要求1所述的重组抗原复合物，其特征在于，所述CFP
‑
10蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。4.根据权利要求1所述的重组抗原复合物，其特征在于，所述CFP
‑
10蛋白和ESAT
‑
6蛋白的摩尔比为1:1。5.根据权利要求1所述的重组抗原复合物，其特征在于，其由前体重组蛋白ESAT
‑6‑
CFP
‑
10经原核表达、酶切获得；所述前体重组蛋白ESAT
‑6‑
CFP
‑
10由N端到C端包括：ESAT
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐延伟，赵巧辉，李桂林，吕委，周同喜，张春鸽，付光宇，杨增利，
申请(专利权)人：郑州伊美诺生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：