一种长效的嵌合抗原受体、载体及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种长效的嵌合抗原受体、载体及其构建方法和应用，所述长效的嵌合抗原受体包括信号肽、靶点的scFv、铰链结构域、跨膜结构域、胞内共刺激结构域、JAK酶激活转导域和胞内信号转导域，由本发明专利技术制备的CAR

【技术实现步骤摘要】
一种长效的嵌合抗原受体、载体及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及基因工程和免疫治疗
，具体来说，涉及一种长效的CAR、载体及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]随着肿瘤免疫学理论和技术的发展，免疫细胞治疗在肿瘤治疗中的作用日益受到重视。研究发现，T淋巴细胞是肿瘤细胞的天敌，在肿瘤免疫应答中起主要作用，对肿瘤细胞有极强的杀伤作用。
[0003]CAR
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NK细胞和CAR
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T细胞免疫疗法作为一种免疫治疗策略，在肿瘤治疗中受到广泛的重视和应用。它是基于免疫系统识别与活化理论，通过基因工程技术，将特异识别肿瘤抗原(单链抗体scFv)、启动免疫活性的元件整合成一个基因，并在体外通过病毒等方法将其转导入患者自身NK细胞或T淋巴细胞中并扩增，之后输回患者体内，使患者重新获得特异性识别肿瘤细胞，有针对性地攻击并杀伤所识别的肿瘤细胞的能力。这种肿瘤治疗技术，在临床上已经显示其强大的对B淋巴性白血病的肿瘤治疗效果，能达到80％治愈B淋巴性白血病的效果。
[0004]CAR
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NK细胞或CAR
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T细胞的持续扩增离不开细胞因子的作用，如IL
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2、IL
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12、IL
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15、IL
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18等，这些细胞因子的作用是通过结合到NK细胞或T细胞表面的细胞因子受体而激活细胞内下游转导信号。例如IL
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15先与IL
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15膜受体的α亚基结合，再与效应NK细胞或T细胞上的IL2R
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γc/IL
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15Rβ形成免疫突触，激活细胞内的JAK1/JAK3和STAT3/STAT5途径等，进而促进NK细胞或T细胞的分化和增殖。目前已有研究者将CAR设计成在激活扩增NK细胞和T细胞的同时分泌细胞因子，可以有效地阻止CAR
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NK/CAR
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T在体内的耗竭。但是，这种分泌型细胞因子不会仅对自身的CAR细胞起作用，也会游离到体液中，引起体内其它免疫细胞的剧烈反应，带来不可预知的副作用，甚至导致死亡。

技术实现思路

[0005]专利技术目的：针对现有CAR
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NK细胞和CAR
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T细胞技术的问题，本专利技术所要解决的技术问题是提供了一种CAR
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NK和CAR
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T治疗载体及其构建方法和应用，增强CAR
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NK和CAR
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T在体内的持久疗效。
[0006]为实现上述技术目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：本专利技术提供了一种长效的嵌合抗原受体，所述长效的嵌合抗原受体包括信号肽、靶点的scFv、铰链结构域、跨膜结构域、胞内共刺激结构域、JAK酶激活信号结构域和胞内信号转导域，所述JAK酶激活信号转导域能够捕获JAK酶并激活，所述JAK酶包括JAK1、JAK2、JAK3或Tyk2，所述JAK1的Gene ID为3716，JAK2的Gene ID为3717，JAK3的Gene ID为3718，Tyk2的Gene ID为7297。
[0007]其中，所述JAK酶激活信号结构域通过招募JAK激酶并在其催化下发生酪氨酸残基的磷酸化，后续激活STAT信号，进而引发胞内的基因转录和表达，因此，起到与细胞因子异曲同工的作用，一旦能够捕获JAK1、JAK2、JAK3或Tyk2中的任何酶的序列均属于本专利技术的保
护范围之内。
[0008]其中，作为优选，所述JAK酶为JAK1酶，所述JAK1酶激活信号转导结构域，其90
‑
99％同一性的氨基酸序列选自以下一个或者其中两个以上叠加：SEQ ID No.1(JAKAcS1)、SEQ ID No.2(JAKAcS2)、SEQ ID No.3(JAKAcS3)、SEQ ID No.4(JAKAcS4)、SEQ ID No.5(JAKAcS5)、SEQ ID No.6(JAKAcS6)、SEQ ID No.7(JAKAcS7)、SEQ ID No.8(JAKAcS8)、SEQ ID No.9(JAKAcS9)、SEQ ID No.10(JAKAcS10)，以上序列均包括JAK1激酶的结合位点和激活信号；以上序列能够捕获JAK1激酶并能够催化其发生氨酸残基的磷酸化激活STAT信号，引发胞内基因转录和表达。
[0009]其中，作为优选，所述JAK1酶激活信号转导结构域的核苷酸序列如下：SEQ ID No.11(JAKAcS1)、SEQ ID No.12(JAKAcS2)、SEQ ID No.13(JAKAcS3)、SEQ ID No.14(JAKAcS4)、SEQ ID No.15(JAKAcS5)、SEQ ID No.16(JAKAcS6)、SEQ ID No.17(JAKAcS7)、SEQ ID No.18(JAKAcS8)、SEQ ID No.19(JAKAcS9)、SEQ ID No.20(JAKAcS10)。
[0010]其中，作为优选，所述JAK酶为JAK3酶，同样能够激活JAK3酶的结构域也在本专利技术的保护范围之内。
[0011]其中，信号肽可引导抗原识别区及铰链区转移到胞外，任意合适的信号肽或信号肽的组合均可实现本专利技术的目的。所述第一信号肽和第二信号肽包括T细胞受体的α链及β链、CD3、CD4、CD5、CD8、CD28、CD33、CD45、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、GM
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CSF、免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链的信号肽。作为优选，信号肽选取CD8α中如SEQ ID No.21所示的信号肽。
[0012]其中，所述靶点的scFv为胞外区包含肿瘤细胞表面高表达的靶点的单链抗体核苷酸序列，所述靶点包含B7H3、NKG2D、GPC3、Claudin18.2、PD
‑
L1、MUC1、Mesothelin、Her2、EGFR、PSMA、CEA、GD2、EpCAM、EGFRvIII、CD70、CD20、CD133、CD177、AFP、AXL、CD171、CD117、C
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MET、FAP、MUC16、NY
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ESO
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1、PSCA、VEGFR
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2、Lewis
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Y、Gp100、FAP、EPHA2中任意一个或几个组合，作为优选，所述靶点为B7H3，其核苷酸序列如SEQ ID No.22所示。
[0013]其中，本专利技术所述靶点结合结构域通过铰链区与其编码的所述跨膜区连接，任意合适的铰链区序列均可实现本专利技术的目的。所述铰链结构域包括以下分子的铰链区：IgG、CD8α、CD28、IL
‑
2受体，例如所述铰链结构域为CD8α，其核苷酸序列如SEQ ID No.23所示。
[0014]其中，所述跨膜结构域为选自以下蛋白质的跨膜结构域或与所述蛋白质本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1. 一种长效的嵌合抗原受体，其特征在于，所述长效的嵌合抗原受体包括信号肽、靶点的scFv、铰链结构域、跨膜结构域、胞内共刺激结构域、JAK酶激活信号转导结构域和胞内信号转导域，所述JAK酶激活信号转导结构域能够捕获JAK酶并激活，所述JAK酶包括JAK1、JAK2、JAK3或Tyk2，所述JAK1的Gene ID为3716，JAK2的Gene ID为3717，JAK3的Gene ID为3718，Tyk2的Gene ID为7297。2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述JAK酶为JAK1酶，所述JAK1酶激活信号转导结构域，其90
‑
99%同一性的序列选自以下一个或者其中两个以上叠加：SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10。3.根据权利要求1所述的长效的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于，所述信号肽包括T细胞受体的α链或β链、CD3、CD4、CD5、CD8、CD28、CD33、CD45、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、GM
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CSF、免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链的信号肽或与所述信号肽具有90
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99%同一性的氨基酸序列。4.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述靶点的scFv为胞外区包含肿瘤细胞表面高表达的靶点的单链抗体核苷酸序列，所述靶点包含B7H3、NKG2D、GPC3、Claudin18.2、PD
‑
L1、MUC1、Mesothelin、Her2、EGFR、PSMA、CEA、GD2、EpCAM、EGFRvⅢ、CD70、CD20、CD133、CD177、AFP、AXL、CD171、CD117、C
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MET、FAP、MUC16、NY
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ESO
‑
1、PSCA、VEGFR
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2、Lewis
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Y、Gp100、FAP、EPHA2中任意一个或几个组合，例如，所述靶点为B7H3，其核苷酸序列如SEQ ID No.22所示。5.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述铰链结构域包括以下分子的铰链区：IgG、CD8α、CD28、IL
‑
2受体，例如CD8α的铰链区的核苷酸序列如SEQ ID No.23所示。6.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜结构域为选自以下蛋白质的跨膜结构域或与所述蛋白质具有90
‑
99%同一性的氨基酸序列：T细胞受体的α、β或ζ链、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD8O、CD86、CD134、CD137或CD154，作为优选，所述跨膜结构域为CD8的跨膜区，其核苷酸序列如SEQ ID No.24所示。7.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内共刺激结构域通过选自以下蛋白质或与所述蛋白质具有90
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99%，同一性的氨基酸序列获得的功能性信号结构...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖忠党，沈杨，孙博，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：