一种生产L-丙氨酸的基因工程菌株及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种生产L

【技术实现步骤摘要】
一种生产L
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丙氨酸的基因工程菌株及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物工程领域，尤其涉及一种生产L
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丙氨酸的基因工程菌株及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]L
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丙氨酸是20种基本氨基酸之一，也是最小的手性分子之一，在食品、医药、日化等领域具有广泛应用。在食品工业中，L
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丙氨酸可以作为防腐剂、甜味剂等添加到食品中。在医药保健中，L
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丙氨酸不仅可用于氨基酸类营养补充剂中，还在急慢性肾衰竭、肝脏疾病、糖尿病、肥胖症等疾病治疗中有重要作用。在日化用品中，L
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丙氨酸可以用于合成氨基酸表面活性剂，具有较高的生物亲和性。
[0003]L
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丙氨酸的生产方法主要包括化学合成法、酶催化法和发酵法。化学合成法主要采用丙酸氯化法工艺，以液氯和丙酸作为主要原料。由于化学合成法的合成路线长、成本高、收率低，目前基本被淘汰。酶催化法主要利用固定化的L
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天冬氨酸
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β
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脱羧酶催化天冬氨酸脱羧生成L
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丙氨酸。但是酶催化法由四碳底物生成三碳产物的碳利用率较低，并且天冬氨酸的价格偏高，因此很难满足大规模生产需求。发酵法主要以葡萄糖为底物，以基因工程手段构建菌株发酵生产L
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丙氨酸，具有原料廉价易得、产品得率高、成本低等优势，因而受到广泛关注。
[0004]与42℃以下的常温发酵相比，高温发酵能够显著降低污染风险、提高原料转化效率并降低热交换成本，因此在大规模发酵生产中有较高的应用价值。丙氨酸发酵通常以基因工程改造的大肠杆菌为生产菌株，但是该菌株的最适生长温度为37℃，无法进行高温发酵。
[0005]因此，本领域的技术人员致力于开发一种能够在高温条件下发酵生产L
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丙氨酸的菌株，以满足大规模生产的需求。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术所要解决的技术问题是提供一种可以在42℃以上的高温条件下生产L
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丙氨酸的基因工程菌株及其构建方法和应用。
[0007]为实现上述目的，本专利技术的第一方面提供了一种生产L
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丙氨酸的基因工程菌株的构建方法，包括如下步骤：
[0008]提供具有丙酮酸合成途径的起始菌；
[0009]进行S200、S300、S400中的任一种步骤、任两种步骤或三种步骤对所述起始菌的基因组进行改造：
[0010]S200：插入6
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磷酸果糖激酶基因pfk的拷贝和丙酮酸激酶基因pyk的拷贝；
[0011]S300：插入具有42℃～55℃热稳定性的丙氨酸脱氢酶基因GSald；
[0012]S400：所述起始菌的基因组中含有丙氨酸消旋酶基因，该步骤包括失活或缺失丙氨酸消旋酶基因。
[0013]本专利技术的第一方面构建得到的生产L
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丙氨酸的基因工程菌株可以在42℃～55℃的高温条件下发酵生产L
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丙氨酸。
[0014]在本专利技术的一些实施方式中，所述起始菌还具有乳酸合成途径，且所述起始菌的基因组中含有乳酸脱氢酶基因；所述的构建方法还包括如下步骤：
[0015]S100：失活或缺失所述起始菌的基因组中的乳酸脱氢酶基因。
[0016]在本专利技术的第二方面，提供了本专利技术的第一方面所述的构建方法构建得到的基因工程菌株。
[0017]在本专利技术的第三方面，提供了本专利技术的第二方面所述的基因工程菌株在生产L
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丙氨酸中的应用。
[0018]在本专利技术的第四方面，提供了一种L
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丙氨酸的生产方法，对本专利技术的第二方面所述的基因工程菌株进行发酵培养，其中，发酵培养温度为42℃～55℃。
[0019]在本专利技术的一些实施方式中，所述发酵培养步骤包括：将所述活化的种子接种到发酵培养基中，所述发酵培养基中包含碳源，在发酵培养温度为42℃～55℃、搅拌速度为50rpm～350rpm的条件下进行分批补料发酵，培养至设定的发酵密度。
[0020]本专利技术公开的技术方案所带来的有益效果包括：
[0021]1、本专利技术提供的基因工程菌株，实现了L
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丙氨酸的高温生产(例如42℃～55℃)，在发酵过程中具有能耗低、抗污染等优点，有效降低了生产成本。
[0022]2、以嗜热菌作为起始菌构建基因工程菌株，可实现在高温条件下(例如42℃～55 ℃，具体地如50℃)进行L
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丙氨酸的发酵生产。进一步地，通过增强糖酵解途径或/ 和引入热稳定性的丙氨酸脱氢酶，可显著提升丙氨酸的产量。通过敲除丙氨酸消旋酶基因可实现光学纯L
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丙氨酸的生产。上述手段的组合可实现高温下高产光学纯L
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丙氨酸的协同增效，发酵生产的温度可高达42℃～55℃，L
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丙氨酸光学纯度可普遍实现98％以上，部分可实现99％以上，一些实施例中光学纯L
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丙氨酸产量能够达到95g/L以上，部分可达到100g/L以上。本专利技术解决了现有技术中生产L
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丙氨酸发酵温度低、成本高等问题，实现了L
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丙氨酸的高温发酵生产，具有较高的工业化利用价值。
[0023]3、对于存在乳酸合成途径的起始菌，通过阻断乳酸合成途径，可增加丙酮酸合成途径的比例，进而实现L
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丙氨酸的增产。采用同时产乳酸和丙酮酸的起始菌，通过阻断起始菌中的乳酸合成途径，可提高丙氨酸合成途径的比例，进一步地，通过增强糖酵解途径并引入热稳定性的丙氨酸脱氢酶，可构建得到高产丙氨酸的基因工程菌株。敲除丙氨酸消旋酶基因可实现光学纯L
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丙氨酸的生产。
[0024]4、以能够50℃高温发酵的地衣芽孢杆菌为例，从一株高产D
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乳酸的地衣芽孢杆菌BN11出发，通过消除其D
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乳酸合成途径，增强糖酵解途径的通量并引入热稳定的异源丙氨酸脱氢酶，还消除D
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丙氨酸的合成途径，可实现在42℃～55℃高温条件下高产光学纯L
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丙氨酸，L
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丙氨酸光学纯度可普遍实现98％以上，部分可实现99％以上；一些实施例中产量可实现95g/L以上，部分可实现100g/L以上。
[0025]以下将结合附图对本专利技术的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本专利技术的目的、特征和效果。
附图说明
[0026]通过阅读参照以下附图，对非限制性实施例所作的详细描述，本专利技术的其它特征、目的和优点将会阐述得更清晰：
[0027]图1是本专利技术的一个实施例中，以地衣芽孢杆菌为例的工程菌中丙氨酸的合成和代谢途径示意图；
[0028]图2是本专利技术的一个实施例中，一种生产L
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丙氨酸的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生产L
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丙氨酸的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：提供具有丙酮酸合成途径的起始菌；进行S200、S300、S400中的任一种步骤、任两种步骤或三种步骤对所述起始菌的基因组进行改造：S200：插入6
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磷酸果糖激酶基因pfk的拷贝和丙酮酸激酶基因pyk的拷贝；S300：插入具有42℃～55℃热稳定性的丙氨酸脱氢酶基因GSald；S400：所述起始菌的基因组中含有丙氨酸消旋酶基因，该步骤包括失活或缺失丙氨酸消旋酶基因。2.如权利要求1所述的生产L
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丙氨酸的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，所述起始菌还具有乳酸合成途径，且所述起始菌的基因组中含有乳酸脱氢酶基因；所述的构建方法还包括如下步骤：S100：失活或缺失所述起始菌的基因组中的乳酸脱氢酶基因。3.如权利要求2所述的生产L
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丙氨酸的基因工程菌株的构建方法，所述起始菌还具有D
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乳酸合成途径，且所述起始菌的基因组中含有D
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乳酸脱氢酶基因ldh
Ti
；所述的构建方法还包括如下步骤S500：失活或缺失所述起始菌的基因组中含有的D
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乳酸脱氢酶基因ldh
Ti
；优选地，所述D
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乳酸脱氢酶基因ldh
Ti
的序列如SEQ ID NO.31所示。4.如权利要求1所述的生产L
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丙氨酸的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，所述6
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磷酸果糖激酶基因pfk的序列如SEQ ID NO.27所示，所述丙酮酸激酶基因pyk的序列如SEQ ID NO.28所示；和/或，所述丙氨酸脱氢酶基因GSald的序列如SEQ ID NO.1所示。5.如权利要求1所述的生产L
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丙氨酸的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，所述步骤S400中，失活或缺失的所述丙氨酸消旋酶基因的种类为1种、2种或更多种；和/或，所述步骤S400包括：失活或缺失丙氨酸消旋酶基因alr1和丙氨酸消旋酶基因alr2；优选地，所述丙氨酸消旋酶基因alr1的序列如SEQ ID NO.29所示，所述丙氨酸消旋酶基因alr2的序列如SEQ ID NO.30所示。6.如权利要求2所述的生产L
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丙氨酸的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，对所述起始菌的基因组进行改造包括步骤S100和步骤S200；优选地，对所述起始菌的基因组进行改造包括步骤S100、步骤S200和步骤S300。7.如权利要求2所述的生产L
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丙氨酸的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，对所述起始菌的基因组进行改造包括步骤S100、步骤S200、步骤S300和步骤S400。8.如权利要求3所述的生产L
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丙氨酸的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：S500：敲除所述起始菌的基因组中含有的D
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乳酸脱氢酶基因ldh
Ti
；S200：插入6
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磷酸果糖激酶基因pfk的拷贝和丙酮酸激酶基因pyk的拷贝；S300：插入异源的丙氨酸脱氢酶基因GSald；和S400：敲除丙氨酸消旋酶基因alr1和丙氨酸消旋酶基因alr2。9.如权利要求1所述的生产L
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丙氨酸的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，在步骤200和步骤300中，插入相关基因的方式为在染色体上增加该基因的拷贝，并在该基因前面
串联启动子。10.如权利要求9所述的生产L
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丙氨酸的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，所述启动子为P
als
。11.如权利要求10所述的生产L
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丙氨酸的基因工程菌株...

【专利技术属性】
技术研发人员：许平，韩笑，陶飞，穆晓玲，陈思弘，李维理，
申请(专利权)人：安徽丰原生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：