离体的兔子骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，公开了离体的兔子骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定方法，离体的兔子骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定方法包括：获取离体的兔子骨髓，并将获取的离体的兔子骨髓用DMEM

【技术实现步骤摘要】
离体的兔子骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定方法


[0001]本专利技术属于生物
，尤其涉及一种离体的兔子骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定方法。

技术介绍

[0002]目前，广泛存在于骨髓、脐带血、脂肪等组织的间充质干细胞(mesenchymal stemcells，MSCs)，具有强大的增殖能力、多向分化潜能、免疫调节功能、来源方便、不存在免疫排斥、无伦理问题等特点，包括MSCs的预处理和扩增、MSCs的条件培养基(Conditionedmedia，CM)、旁分泌因子、分泌蛋白质组、外泌体、细胞外囊泡(Extracellularvesicles，EVs)在内的MSCs衍生物，具有更低的免疫原性、性质稳定、无成瘤及血栓风险等特点，采用MSCs及其衍生物相关细胞疗法和无细胞疗法可能是治疗各种复杂疾病的最佳解决方案。MSCs及其衍生物作为疾病创新疗法的成功很可能取决于更好地理解其的作用机制，以及确定在临床环境中使用它们的最佳策略，因此需要大量的原代间充质干细胞进行实验研究。现有的原代间充质干细胞来源有限，实验研究需大量使用3
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5代培养细胞，现有的原代间充质干细胞提取及分离方法操作复杂，细胞产量和成活率低，不能满足多种生理生化实验的要求。
[0003]通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有的原代间充质干细胞提取及分离方法操作复杂，细胞产量和成活率低，不能满足多种生理生化实验的要求；同时现有的原代间充质干细胞来源有限，不能满足实验研究的需求。

技术实现思路

[0004]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种离体的兔子骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定方法。
[0005]本专利技术是这样实现的，一种离体的兔子骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定方法，所述离体的兔子骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定方法包括：
[0006]步骤一，获取离体的兔子骨髓，并将获取的离体的兔子骨髓接种于培养瓶中并放置于培养箱中进行培养；
[0007]步骤二，于细胞培养一段时间后传代培养至第3代，得到离体的兔子骨髓间充质干细胞。
[0008]进一步，所述步骤一中，接种包括：将获取的离体的兔子骨髓以直接贴壁法接种于培养瓶中。
[0009]进一步，所述步骤一中，将获取的离体的兔子骨髓接种于培养瓶中并放置于培养箱中进行培养包括：
[0010]将获取的离体的兔子骨髓用DMEM
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F12培养液以直接贴壁法接种于培养瓶中并放置于培养箱中进行培养。
[0011]进一步，所述DMEM
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F12培养液含10％胎牛血清。
[0012]进一步，所述步骤一中，接种密度为：1
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104个/cm。
[0013]进一步，所述培养包括：于37℃、5％CO2及饱和湿度的培养箱内培养。
[0014]进一步，所述培养还包括：24h后半量换液；以后3～4d换液并确定细胞生长情况。
[0015]进一步，所述传代培养包括：按1：2比例进行传代培养。
[0016]进一步，所述于细胞培养一段时间后传代培养至第3代包括：于细胞培养7
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8天，达到80％融合后传代培养至第3代。
[0017]进一步，所述离体的兔子骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定方法还包括：确定MSCs的形态学，用流式细胞术检测所培养细胞的特异性抗原。
[0018]结合上述的技术方案和解决的技术问题，请从以下几方面分析本专利技术所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
[0019]第一、针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本专利技术的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本专利技术技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：
[0020]本专利技术提供了一种离体的兔子骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定方法，操作简单，细胞产量和成活率高。本方明能够为间充质干细胞的研究和应用提供了丰富的材料来源。
[0021]本专利技术通过大量获取的兔子骨髓，可显著提高原代间充质干细胞产量；本专利技术将细胞悬液接种至培养瓶中细胞生长速率较快，可快速扩增，且培养3代后间充质干细胞性状稳定，扩增量大。因兔骨髓间充质干细胞表征：本专利技术通过单克隆抗体筛选，流式细胞学检测可精确检测培养扩增细胞是否为所需兔骨髓间充质干细胞。
[0022]第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本专利技术所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：
[0023]本专利技术的离体的兔子骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定方法是一种较为理想的离体的兔子骨髓间充质干细胞培养方法，可以满足多种生理生化实验的要求。
[0024]本专利技术所获得的兔骨髓MSCs纯度高，活力较强；且本专利技术培养细胞所需时间短，原代细胞培养7
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8天后细胞即可生长至快速扩增期；对分离的细胞无损伤。本专利技术能够提供具有稳定数量、高质量扩增培养兔骨髓MSCs，可高效满足多种生理生化实验的要求。
附图说明
[0025]图1是本专利技术实施例提供的离体的兔子骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定方法流程图；
[0026]图2是本专利技术实施例提供的原代兔骨髓MSC的电镜图；
[0027]图3是本专利技术实施例提供的三代兔骨髓MSC的电镜图；
[0028]图4是本专利技术实施例提供的流式细胞仪检测显示图。
具体实施方式
[0029]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0030]一、解释说明实施例。为了使本领域技术人员充分了解本专利技术如何具体实现，该部分是对权利要求技术方案进行展开说明的解释说明实施例。
[0031]如图1所示，本专利技术实施例提供的离体的兔子骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定方法包括：
[0032]S101，获取离体的兔子骨髓，并将获取的离体的兔子骨髓接种于培养瓶中并放置于培养箱中进行培养；
[0033]S102，于细胞培养一段时间后传代培养至第3代，得到离体的兔子骨髓间充质干细胞。
[0034]下面结合具体实施例对本专利技术的技术方案作进一步说明。
[0035]本专利技术实施例提供的离体的兔子骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定方法包括：
[0036]3％戊巴比妥耳缘静脉注射麻醉兔子后，选取双侧胫骨结节和双侧髂后上嵴为穿刺点抽取骨髓约4ml，以直接贴壁法，用含10％胎牛血清的DMEM
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F12培养液接种到25cm2培养瓶中，接种密度约1
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104个/cm，于37℃、5％CO2及饱和湿度的培养箱内培养，24h后半量换液，以后3～4d换液并观察细胞生长情况。细胞培养7～8d达到80％融合后按1：2比例传代培养至第3代备用。观察MSCs的形本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种离体的兔子骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定方法，其特征在于，所述离体的兔子骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定方法包括：步骤一，获取离体的兔子骨髓，并将获取的离体的兔子骨髓接种于培养瓶中并放置于培养箱中进行培养；步骤二，于细胞培养一段时间后传代培养至第3代，得到离体的兔子骨髓间充质干细胞。2.如权利要求1所述离体的兔子骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定方法，其特征在于，所述步骤一中，接种包括：将获取的离体的兔子骨髓以直接贴壁法接种于培养瓶中。3.如权利要求1所述离体的兔子骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定方法，其特征在于，所述步骤一中，将获取的离体的兔子骨髓接种于培养瓶中并放置于培养箱中进行培养包括：将获取的离体的兔子骨髓用DMEM
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F12培养液以直接贴壁法接种于培养瓶中并放置于培养箱中进行培养。4.如权利要求3所述离体的兔子骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定方法，其特征在于，所述DMEM
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F12培养液含10％胎牛血清。5.如权利要求1所述离体的兔子骨髓间充质干细胞的分离...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱峰，王玉松，马琪敏，王丹，尹希，伍国胜，朱世辉，黄圣宇，朱志豪，马少林，
申请(专利权)人：中国人民解放军海军军医大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：