乙肝病毒x蛋白（HBx）稳定过表达细胞及其高脂模型的构建方法技术

本发明专利技术提供一种乙肝病毒x蛋白（HBx）稳定过表达细胞及其高脂模型的构建方法。本发明专利技术选择了C57BL/6小鼠胎鼠来源的肝前体细胞作为模型，规避了人体试验的伦理风险。本发明专利技术采用慢病毒转染法使原代细胞转化为永生化细胞株，进行长期传代及进一步实验，另外在高脂造模实验中本发明专利技术使用单一的商品化油酸钠作为诱导剂，并筛选出适宜的诱导周期与浓度，这一方法步骤固定，从实验结果看对目的细胞几乎没有损伤。综上本发明专利技术的细胞模型材料易得、简单经济、且生物学功能稳定，具有很好的应用价值。具有很好的应用价值。具有很好的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
乙肝病毒x蛋白(HBx)稳定过表达细胞及其高脂模型的构建方法


[0001]本专利技术属于生物医药
，涉及细胞模型，具体涉及一种构建高脂乙肝病毒x蛋白(HBx)稳定表达细胞模型的方法。

技术介绍

[0002]乙肝病毒(HBV)感染是目前一个严重的全球性公共卫生问题，每年因HBV感染所致的肝硬化、肝衰竭和原发性肝细胞癌(HCC)去世的患者达65万人。我国1～59岁的一般人群中约7.18％(1亿余)的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)检测阳性，其内约2000万人为需要治疗的活动性乙型肝炎患者。临床观察上发现，在乙型肝炎患者体内，随着病程的延长，HBV对肝细胞的破坏就更厉害，患者的进食及蛋白消化功能也随之受影响，导致蛋白质缺乏，进而不能合成载脂蛋白，以致甘油三酯不能及时转移出肝脏，积存于肝内，最后形成脂肪肝。
[0003]乙型肝炎病毒编码的X蛋白作为四种表达蛋白之一，是一种多功能调节蛋白，在病毒复制中起重要作用。目前研究已明确，HBx蛋白是HBV感染引起肝脏脂肪性病变的元凶。HBx诱导脂质积累的机制复杂，早期研究发现HBx诱导肝脂肪变性可通过抑制PTEN，上调PI3K/Akt从而激活SREBP
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1或是LXRα的表达，促进FAS，ACC，SCD，CD36，AP2以及Adiponectin等脂肪形成相关蛋白的表达上调。最近发现HBx能通过激活LXRa
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Srebp1c通路促进脂质的积累。另外HBx也能够激活C/EBPα，上调PPARγ的转录激活作用，促进FABP1蛋白的表达，引起肝组织的脂质积累。因此深入探究HBx诱导脂肪病变的机制以及靶向相关通路或分子是改善乙型肝炎合并脂肪肝的关键。
[0004]目前，探究HBx诱导脂肪肝病变的体外模型较少，主要的模型是通过慢病毒转染法，将HBx基因稳定转染进入人肝癌细胞HepG2或Huh7中，再通过混合脂肪酸溶液(棕榈酸：油酸＝2:1)构建高脂稳定表达HBx蛋白的人肝癌细胞。这一模型的缺点是：1)细胞为人类肿瘤来源不能模仿正常细胞感染后细胞功能的改变，由于HBV在肝脏进行感染时通常会激活动物的肝前体细胞，进而促进其增殖，使得肝纤维化发生进一步导致原发性肝细胞癌；2)由于细胞的特殊性在HBx转染后增殖受到影响；3)在构建高脂模型时通常使用棕榈酸与油酸混合液，但此诱导剂制备复杂且有明显细胞毒性。综上所述，业界亟需一种可操作性强、具有模拟正常细胞被HBx影响的模型。这对于HBx诱导肝脏脂肪性病变治疗的研究、HBV合并脂肪肝发病机制的研究具有十分重要的意义。

技术实现思路
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[0005]为了解决现有高脂诱导HBx转染细胞模型的多种缺陷，本专利技术提供一种模拟正常肝前体细胞在转染HBx后的细胞模型。同时，专利技术人研究出仅使用一种脂肪酸诱导的高脂HBx过表达细胞模型，这一模型可以模拟HBx感染肝前体细胞后继而在高脂环境下其持续表达对细胞多种功能的影响。在本专利技术中，基于人源肝前体细胞难已获得且不能构建为永生化细胞株，而小鼠来源的细胞模型可用于多种人类疾病研究，生物功能上具有高度共同性，
且可以开发为稳定传代的细胞株。本专利技术开创性选择了C57BL/6小鼠的胎鼠来源的肝前体细胞作为模型，规避了人体试验的伦理风险。相对于其他类型的小鼠(如具有免疫缺陷的小鼠)本专利技术使用了廉价易得且免疫功能正常的C57BL/6小鼠，后续实验也采用常规易操作的慢病毒转染法使原代细胞转化为永生化细胞株，可进行长期传代及进一步实验，另外在高脂造模实验中本专利技术使用单一的商品化油酸钠作为诱导剂，并筛选出适宜的诱导周期与浓度，这一方法步骤固定，从实验结果看对目的细胞几乎没有损伤。综上本专利技术的细胞模型材料易得、简单经济、且生物学功能稳定，具有很好的应用价值。
[0006]本专利技术的上述目的通过以下技术方案得以实现：
[0007]一种C57BL/6小鼠鼠源永生化肝前体细胞，其特征在于，采用如下方法制备：从C57BL/6孕鼠的胎鼠体内分离肝组织，用无血清DMEM培养基冲洗，用胰蛋白酶于室温下消化10
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30min，用含胎牛血清的DMEM培养基(含10％胎牛血清)终止消化，反复吹打至细胞分散；500
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3000rpm离心2
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8min，弃上清液,再将细胞重悬于含胎牛血清的DMEM培养基(含10％胎牛血清)，接种于Matrigel基质胶(DPBS:基质胶＝500:1)包被的T
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25细胞培养瓶中，置35
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40℃、2
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8％CO2孵箱培养得到C57BL/6小鼠肝前体细胞；将C57BL/6小鼠肝前体细胞使用含胎牛血清的完全培养基(含10％胎牛血清)培养传1～2代后接种于T
‑
25细胞培养瓶中，观察细胞融和度≥40％后吸去陈旧培养基，加入含Polybrene和SSR#69逆转录病毒液的DMEM培养基(0.1％SSR#69逆转录病毒液+DMEM培养基+8μg/mL Polybrene，无血清)转染，然后通过300
‑
500μg/mL潮霉素B溶液持续筛选1
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3周，获得初代稳定的永生化鼠源肝前体细胞株；将初代稳定的永生化鼠源肝前体细胞株转移至12孔板中，用100
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250μg/mL潮霉素B溶液继续筛选1
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3周，获得稳定的鼠源单克隆永生化肝前体细胞(命名为HP14
‑
19细胞)。
[0008]进一步，所述C57BL/6孕鼠为12
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18天的C57BL/6孕鼠。更进一步，优选13
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17天的C57BL/6孕鼠；最优选15d
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C57BL/6孕鼠。
[0009]上述方法中，所述SSR#69逆转录病毒液的制备方法为使用脂质体法，通过联合使用lipofectamine转染试剂，制备SSR#69逆转录病毒液。
[0010]上述方法中，通过western blotting对HP14
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19细胞中永生化标志物SV40大T抗原进行检测，证明细胞构建成功。
[0011]高脂稳定HBx过表达肝前体细胞模型的构建方法，其特征在于，先构建携带HBx基因的慢病毒质粒；然后使用HEK
‑
293T细胞对慢病毒质粒进行包装得到慢病毒工作液；再使用慢病毒工作液感染HP14
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19肝前体细胞，并进行稳定细胞株的筛选，获得具有绿色荧光的HBx
‑
EGFP
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HP14
‑
19细胞；再通过qRT
‑
PCR、Western blots鉴定构建成功细胞；最后使用油酸(OA)钠诱导HBx
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EGFP
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HP14
‑
19细胞构建高脂稳定HBx过表达肝前体细胞模型。
[0012]上述高脂稳定HBx过表达肝前体细胞模型通过检测油红O染色(ORO)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(T本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种C57BL/6小鼠鼠源永生化肝前体细胞，其特征在于，采用如下方法制备：从C57BL/6孕鼠的胎鼠体内分离肝组织，用无血清DMEM培养基冲洗，用胰蛋白酶于室温下消化10
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30min，用含胎牛血清的DMEM培养基(含10％胎牛血清)终止消化，反复吹打至细胞分散；500
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3000rpm离心2
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8min，弃上清液,再将细胞重悬于含胎牛血清的DMEM培养基(含10％胎牛血清)，接种于Matrigel基质胶(DPBS:基质胶＝500:1)包被的T
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25细胞培养瓶中，置35
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40℃、2
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8％CO2孵箱培养得到C57BL/6小鼠肝前体细胞；将C57BL/6小鼠肝前体细胞使用含胎牛血清的完全培养基(含10％胎牛血清)培养传1～2代后接种于T
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25细胞培养瓶中，观察细胞融和度≥40％后吸去陈旧培养基，加入含Polybrene和SSR#69逆转录病毒液的DMEM培养基(0.1％SSR#69逆转录病毒液+DMEM培养基+8μg/mL Polybrene，无血清)转染，然后通过300
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500μg/mL潮霉素B溶液持续筛选1
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3周，获得初代稳定的永生化鼠源肝前体细胞株；将初代稳定的永生化鼠源肝前体细胞株转移至12孔板中，用100
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250μg/mL潮霉素B溶液继续筛选1
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3周，获得稳定的鼠源单克隆永生化肝前体细胞。2.如权利要求1所述的C57BL/6小鼠鼠源永生化肝前体细胞，其特征在于，所述C57BL/6孕鼠为12
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18天的C57BL/6孕鼠；优选13
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17天的C57BL/6孕鼠；最优选15d
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C57BL/6孕鼠。3.一种高脂稳定HBx过表达肝前体细胞模型的构建方法，其特征在于，先构建携带HBx基因的慢病毒质粒；然后使用HEK
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293T细胞对慢病毒质粒进行包装得到慢病毒工作液；再使用慢病毒工作液感染如权利要求1或2所述的HP14
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19肝前体细胞，并进行稳定细胞株的筛选，获得具有绿色荧光的HBx
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EGFP
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HP14
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19细胞；再通过qRT
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PCR、Western blots鉴定构建成功细胞；最后使用油酸(OA)钠诱导HBx
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EGFP
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HP14
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19细胞构建高脂稳定HBx过表达肝前体细胞模型。4.如权利要求3所述高脂稳定HBx过表达肝前体细胞模型的构建方法，其特征在于，通过检测油红O染色(ORO)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、游离脂肪酸(FFA)水平确定是否造模成功。5.如权利要求3或4所述高脂稳定HBx过表达肝前体细胞模型的构建方法，其特征在于，携带HBx基因的慢病毒质粒中目的基因的扩增序列为：HBx前引物：CCTCTCTTTACGCGGTCTCG；后引物：TGGGTCGTTCACATTGCTGA。6.如权利要求3所述高脂稳定HBx过表达肝前体细胞模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)通过构建携带HBx基因的慢病毒质粒针对HBx基因进行引物设计，通过PCR进行扩增：用限制性内切酶EcoRI和BamHI对含有HBx的质粒和载体进行酶切；扩增后通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定与分离，然后制备表达载体pLenti
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CMV
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HA
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3FLAG
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PGK
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EGFP
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F2A
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Puro；利用T4 DNA连接酶将目的基因片段和表达载体进行连接反应；再采用CaCl2法制备转化EcoliDH5α感受态细菌得到菌液；最后按照试剂盒说明书进行质粒提取；所述PCR引物序列为：HBx前引物：CCTCTCTTTACGCGGTCTCG；后引物：TGGGTCGTTCACATTGCTGA；(2)使用HEK
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293T细胞进行病毒包装；(3)使用慢病毒工作液感染HP14
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19肝前体细胞，并进行稳定细胞株的筛选；
(4)通过qRT
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PCR、Western blots鉴定所构建...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯涛，卢杨，杨鑫玥，王薛，况钦，吴勇，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：