一种荧光PCR技术筛查和鉴定IRF4重排相关融合基因的引物及探针、组合物和方法技术

本发明专利技术涉及用荧光PCR技术筛查和鉴定IRF4重排相关融合基因的引物及探针、组合物和方法，筛查及鉴定的相关融合基因包括DUSP22

【技术实现步骤摘要】
一种荧光PCR技术筛查和鉴定IRF4重排相关融合基因的引物及探针、组合物和方法


[0001]本专利技术属生命科学和生物
，涉及特别涉及一种采用多重荧光PCR技术筛查IRF4重排相关融合基因的引物及探针、组合物和方法。
技术背景
[0002]IRF4是干扰素调节因子(IRF)家族的成员之一，因其最先在多发性骨髓瘤中被发现，故其也被称为多发性骨髓瘤癌基因1(MUM1)。IRF家族共有10个成员，是干扰素信号的下游调节者。与其它IRF家族的蛋白不同，IRF4的表达不受干扰素的影响，而是由与淋巴细胞的活化有关的刺激物介导的。IRF4通过一系列的信号转导作用激活或抑制特定基因的表达，参与免疫调控、介导免疫相关细胞如淋巴细胞、髓系细胞、树突状细胞等的发育和分化。
[0003]IRF4主要在淋巴细胞中表达，并且有一定的种系和阶段特异性。很多研究发现并完善了B细胞和T细胞分化发育中依赖IRF4的细节。在B系细胞中，整个B细胞发育过程中IRF4有不同水平表达，在一小部分GCB细胞、生发中心后B细胞和浆细胞中表达率更高，即IRF4的表达在GCB细胞向浆细胞分化成熟的终末阶段达到高峰。而在T系细胞中，正常T细胞与异常活化的T细胞均有IRF4的表达。IRF4是转录因子，在调节免疫反应、免疫细胞的发育和分化、细胞生长调节和代谢中起着关键作用，且对浆细胞的分化至关重要。
[0004]IRF4在肿瘤组织中激活导致过表达或者易时易位表达而引起调控异常，是肿瘤发生的一个重要原因。IRF4基因表达异常会导致淋巴组织增生性疾病发生，并与淋巴瘤的预后有一定的联系。弥漫大B细胞淋巴瘤(Diffuse large B
‑
cell lymphoma，DLBCL)是最常见的恶性淋巴瘤，占NHL的30
‑
40％，具有很强的异质性，其临床表现及预后等方面存在较大差异，有研究表明，IRF4/MUM1在DLBCL中的表达与活化的DLBCL以及一些预后较差的DLBCL相关。
[0005]IRF4重排的大B细胞淋巴瘤(largeB cell lymphoma，LBCL)是淋巴造血系统肿瘤WHO分类2017年修订版中新提出的一种少见亚型的LBCL，其组织学上兼具滤泡性淋巴瘤(follicular lymphoma，FL)和/或弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)的特征。而在IRF4重排的LBCL中，多由于IgH/IRF4融合及少数IgL/IRF4或IgK/IRF4融合，导致了MUM1的过表达。该肿瘤好发于儿童和年轻人，多数病例局限于头颈部、伴IRF4基因重排及总体预后较好。及早发现IRF4重排对LBCL及相关罕见肿瘤的诊断治疗至关重要。
[0006]临床对于融合基因的发现，检测及作为微小残留病灶靶标进行监测都是有强烈需求的。无论这个分子标记物是否与预后相关联，融合基因都是一个不错的监测靶标。染色体核型分析对于各种染色体易位，倒位的变化检出率并不是100％的；该方法受到细胞培养，核分裂相的个数，结构变化的微小程度，显带的明显程度及技术人员观察判断能力的影响。FISH方法成本高，灵敏度不及PCR；而PCR联合电泳的方法耗时长，过程繁琐，易污染，结果的判断较主观。且PCR反应体系越多，成本越高，不适用于高通量的样本筛查。

技术实现思路

[0007]鉴于目前筛查IRF4重排相关融合基因的方法学不能同时满足经济高效、结果准确且能用于MRD监测等需求，故本专利技术设计出一套用于多重荧光PCR技术检测IRF4重排常见融合基因的引物、探针，并构思出一种灵敏度高，特异性好，检测通量大，快速且准确的筛查及型别鉴定方案。
[0008]一种用荧光PCR技术筛查及鉴定DUSP22
‑
IRF4 E2,SH3GL1
‑
IRF4E2,DOT1L
‑
IRF4 E2,EFNA2
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IRF4 E2,AP3D1
‑
IRF4 E2,LTBR
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IRF4 E2,DUSP22
‑
IRF4 E5,SH3GL1
‑
IRF4 E5,DOT1L
‑
IRF4 E5,EFNA2
‑
IRF4 E5,AP3D1
‑
IRF4 E5,LTBR
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IRF4 E5，DUSP22
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IRF4 E7,SH3GL1
‑
IRF4 E7,DOT1L
‑
IRF4 E7,EFNA2
‑
IRF4 E7,AP3D1
‑
IRF4 E7,LTBR
‑
IRF4 E7这18种相对常见IRF4重排相关融合基因的引物及探针，其特征在于采用多重荧光PCR技术，将存在于IRF4基因的上游引物、及其对应的探针分成两组，配对不同的下游基因上的多条下游引物。其核苷酸序列如下：
[0009][0010][0011]筛查上述融合基因的引物探针还包括扩增作为内参的管家基因ABL的引物和探针，其核苷酸序列如下：
[0012]ABL
‑
F：5
’‑
GATACGAAGGGAGGGTGTACCA
‑3’
[0013]ABL
‑
R：5
’‑
CTCGGCCAGGGTGTTGAA
‑3’
[0014]ABL
‑
P：5
’‑
HEX
‑
TGCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT
‑
TAMRA
‑3’
[0015]本专利技术的创新点在于：
[0016]1.IRF4基因发生重排时，断裂位点主要集中于内含子2，5，7，导致IRF4外显子2，5，7与其他基因发生融合；而其中最常见的融合基因断裂融合位置在IRF4的5内含子，最少见的为7内含子。为了尽量多地囊括各种IRF4重排产生的融合基因，又使PCR反应尽量减少相互干扰，一管PCR反应中的引物探针尽量单一，本专利技术选择在IRF4的第2、5和7外显子上各设计一条引物及其对应的探针，作为IRF4重排相关融合基因筛查的共用引物探针。同时将PCR扩增产物的长度尽量控制在150bp以内，以满足荧光PCR技术的检测范围要求。IRF4引物探针设计方案见图1的IRF4演示图，其中箭头代表引物和探针的方向。
[0017]2.IRF4基因的断裂位点有10处之多，而与其发生融合的伴侣基因仅已报道的也多达10种以上。为了尽量减少检测的反应数，提高通量，节约成本，本专利技术在上游引物设计时
需兼顾各种融合方式能检测到，又不宜使一个PCR反应体系中引物过于繁多，相互干扰。上游引物位置设计方案见图1的LTBR,AP3D1,SH3GL1,DUSP22,DOT1L,EFNA2演示图，其中箭头代表引物的方向。
[0018]3.IR本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用多重荧光PCR技术筛查及鉴定DUSP22
‑
IRF4 E2,SH3GL1
‑
IRF4E2,DOT1L
‑
IRF4 E2,EFNA2
‑
IRF4 E2,AP3D1
‑
IRF4 E2,LTBR
‑
IRF4 E2,DUSP22
‑
IRF4 E5,SH3GL1
‑
IRF4 E5,DOT1L
‑
IRF4 E5,EFNA2
‑
IRF4E5,AP3D1
‑
IRF4 E5,LTBR
‑
IRF4 E5,DUSP22
‑
IRF4 E7,SH3GL1
‑
IRF4 E7,DOT1L
‑
IRF4 E7,EFNA2
‑
IRF4 E7,AP3D1
‑
IRF4 E7,LTBR
‑
IRF4 E7共18种IRF4重排相关融合基因的引物及探针，其特征在于，所述引物和探针的核苷酸序列如下：2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，用于DUSP22
‑
IRF4 E2融合基因检测引物和探针的核苷酸序列是：DUSP22E6
‑
F，IRF4 E2
‑
R，IRF4 E2
‑
P；用于SH3GL1
‑
IRF4 E2融合基因检测引物和探针的核苷酸序列是：SH3GL1E4
‑
F，IRF4 E2
‑
R，IRF4 E2
‑
P；用于DOT1L
‑
IRF4 E2融合基因检测引物和探针的核苷酸序列是：DOT1L E5
‑
F，IRF4 E2
‑
R，IRF4 E2
‑
P；用于EFNA2
‑
IRF4 E2融合基因检测引物和探针的核苷酸序列是：EFNA2 E2
‑
F，IRF4 E2
‑
R，IRF4 E2
‑
P；用于AP3D1
‑
IRF4 E2融合基因检测引物和探针的核苷酸序列是：AP3D1 E6
‑
F，IRF4 E2
‑
R，IRF4 E2
‑
P；用于LTBR
‑
IRF4 E2融合基因检测引物和探针的核苷酸序列是：LTBR E3
‑
F，IRF4 E2
‑
R，IRF4 E2
‑
P；用于DUSP22
‑
IRF4 E5融合基因检测引物和探针的核苷酸序列是：DUSP22E6
‑
F，IRF4 E5
‑
R，IRF4 E5
‑
P；用于SH3GL1
‑
IRF4 E5融合基因检测引物和探针的核苷酸序列是：SH3GL1E4
‑
F，IRF4 E5
‑
R，IRF4 E5
‑
P；用于DOT1L
‑
IRF4 E5融合基因检测引物和探针的核苷酸序列是：DOT1L E5
‑
F，IRF4 E5
‑
R，IRF4 E5
‑
P；用于EFNA2
‑
IRF4 E5融合基因检测引物和探针的核苷酸序列是：EFNA2
‑
F，IRF4 E5
‑
R，IRF4 E5
‑
P；用于AP3D1
‑
IRF4 E5融合基因检测引物和探针的核苷酸序列是：AP3D1 E6
‑
F，IRF4 E5
‑
R，IRF4 E5
‑
P；
用于LTBR
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IRF4E5融合基因检测引物和探针的核苷酸序列是：LTBRE3
‑
F，IRF4E5
‑
R，IRF4E5
‑
P；用于DUSP22
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IRF4E7融合基因检测引物和探针的核苷酸序列是：DUSP22E6
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F，IRF4E7
‑
R，IRF4E7
‑
P；用于SH3GL1
‑
IRF4E7融合基因检测引物和探针的核苷酸序列是：SH3GL1E4
‑
F，IRF4E7
‑
R，IRF4E7
‑
P；用于DOT1L
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IRF4E7融合基因检测引物和探针的核苷酸序列是：DOT1LE5
‑
F，IRF4E7
‑
R，IRF4E7
‑
P；用于EFNA2
‑
IRF4E7融合基因检测引物和探针的核苷酸序列是：EFNA2
‑
F，IRF4E7
‑
R，IRF4E7
‑
P；用于AP3D1
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IRF4E7融合基因检测引物和探针的核苷酸序列是：AP3D1E6
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F，IRF4E7
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R，IRF4E7
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P；用于LTBR
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IRF4E7融合基因检测引物和探针的核苷酸序列是：LTBRE3
‑
F，IRF4E7
‑
R，IRF4E7
‑
P。3.根据权利要求1或2所述的引物和探针，其特征在于，还包括扩增作为内参的管家基因ABL的引物和探针，其核苷酸序列如下：ABL
‑
F：5
’‑
GATACGAAGGGAGGGTGTACCA
‑3’
ABL
‑
R：5
’‑
CTCGGCCAGGGTGTTGAA
‑3’
ABL
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P:5
’‑
HEX
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TGCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT
‑
TAMRA
‑3’
。4.用多重荧光PCR技术筛查及鉴定DUSP22
‑
IRF4E2,SH3GL1
‑
IRF4E2,DOT1L
‑
IRF4E2,EFNA2
‑
IRF4E2,AP3D1
‑
IRF4E2,LTBR
‑
IRF4E2,DUSP22
‑
IRF4E5,SH3GL1
‑
IRF4E5,DOT1L
‑
IRF4E5,EFNA2
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：王淑一，陈雪青，于晓钟，
申请(专利权)人：济南艾迪康医学检验中心有限公司，
类型：发明
国别省市：