一种提高乳酸乳球菌抗氧化活性的方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种提高乳酸乳球菌抗氧化活性的方法及其应用，一种提高乳酸乳球菌抗氧化活性的方法，通过构建产番茄红素的重组乳酸菌，从而提高乳酸乳球菌抗氧化活性，构建产番茄红素的重组乳酸菌方法为构建番茄红素异源合成质粒，敲除乳酸乳球菌中乳酸脱氢酶(ldh)基因或过表达不同来源菌株中的MVA途径基因，得到重组乳酸乳球菌，从而实现乳酸乳球菌异源合成番茄红素。与现有技术相比，本发明专利技术通过构建一株产番茄红素的重组乳酸菌，测定自身和在脱脂乳中的抗氧化活性，发现重组乳酸乳球菌的抗氧化活性比出发菌株提高了1倍以上，且DPPH、ABTS和

【技术实现步骤摘要】
一种提高乳酸乳球菌抗氧化活性的方法及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种提高乳酸乳球菌抗氧化活性的方法及其应用。

技术介绍

[0002]活性氧(reactive oxygen species，ROS)是活细胞进行有氧代谢的正常产物，当机体受到外界环境因子的应激时会产生过量ROS，如超氧阴离子自由基、羟自由基和过氧化氢等，使细胞内DNA、蛋白质、脂质等大分子发生变性，导致细胞损伤、功能丧失，引起细胞凋亡和坏死。因此，氧化与抗氧化的平衡对于维持机体正常生理功能的发挥和健康至关重要。
[0003]乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)属于乳酸菌中重要的成员之一，最早是从植物中分离出来
[1]。作为目前研究最为广泛的乳酸菌模式菌株，随着2001年完成对乳酸乳球菌全基因组测序，已成为大肠杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌之后最受关注的外源基因表达宿主，是目前最为完善的乳酸菌基因克隆和表达系统
[2]。乳酸乳球菌作为发酵剂在奶酪和其它发酵食品中广泛使用，但在工业发酵生产中必然遭受ROS氧化胁迫，使其发酵活力降低。且乳酸乳球菌中没有高效的过氧化氢酶(CAT)来清除自由基和过氧化氢，因此会对菌体造成损害。常见的解决办法是表达抗氧化酶或合成活性肽，如过表达SOD或CAT，导入谷胱甘肽(GSH)生物合成途径导入等策略，但此类方法对于乳酸乳球菌抗氧化活性总体提高较低。因此，提高乳酸乳球菌的抗氧化活性有着重要的应用价值。
[0004]番茄红素是一种C
40
类异戊二烯化合物，具有很强的抗氧化性和提高免疫力等功效，已广泛应用于食品和化妆品等行业
[3]。番茄红素是目前自然界中已知的最强抗氧化剂之一，番茄红素的抗氧化作用是β
‑
胡萝卜素的两倍以上，是维生素E的100倍。
[0005][1]吕懿超,李香澳,王凯博,等.乳酸菌作为生物保护菌的抑菌机理及其在食品中应用的研究进展[J].食品科学,2021(19):281
‑
290.
[0006][2]Xiong Z Q,Wei Y Y,Kong L H,et al.Short communication:An inducible CRISPR/dCas9 gene repression system in Lactococcus lactis[J].Journal of Dairy Science,2019,103(1):161
‑
165.
[0007][3]Liang X,Ma C,Yan X,et al.Advances in research on bioactivity,metabolism,stability and delivery systems of lycopene[J].Trends in Food Science&Technology,2019,93:185
‑
196.

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种提高乳酸乳球菌抗氧化活性的方法及其应用，本专利技术将番茄红素合成基因在乳酸乳球菌中异源表达，通过敲除乳酸脱氢酶(ldh)基因和培养条件优化，实现了乳酸乳球菌合成番茄红素，使乳酸乳球菌工程菌抗氧化活性比对照菌株显著提高。
[0009]本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：
[0010]一种提高乳酸乳球菌抗氧化活性的方法，将crtE、crtB和crtI三个异源酶基因导入重组乳酸菌中，实现重组乳酸菌异源合成番茄红素，从而提高重组乳酸菌抗氧化活性；
[0011]所述crtE异源酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
[0012]所述crtB异源酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
[0013]所述crtI异源酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0014]进一步地，将pGZQ01质粒导入重组乳酸菌中，实现乳酸乳球菌异源合成番茄红素，从而提高乳酸乳球菌抗氧化活性，
[0015]所述pGZQ01质粒中含有crtE、crtB和crtI三个异源酶基因，pGZQ01质粒的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
[0016]乳酸菌以内源IPP和DMAPP合成FPP为前体，通过crtE、crtB和crtI三个异源酶连续催化合成番茄红素。结合KEGG代谢途径分析发现乳酸菌具有完整MVA途径，但缺乏crtE、crtB和crtI三个酶基因，所以不能合成番茄红素，而pGZQ01质粒携带这3个酶基因。
[0017]进一步地，所述重组乳酸菌来源于敲除乳酸脱氢酶(ldh)基因的乳酸乳球菌，所述乳酸脱氢酶(ldh)基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
[0018]上述更进一步地，所述乳酸乳球菌为NZ9000。
[0019]进一步地，所述重组乳酸菌来源于敲除乳酸脱氢酶(ldh)基因且过表达MVA途径基因的乳酸乳球菌。
[0020]上述更进一步地，所述MVA途径基因为乳酸乳球菌NZ9000、嗜热链球菌S
‑
3或植物乳杆菌AR113中的MVA途径基因。
[0021]上述更进一步地，所述过表达MVA途径的基因为嗜热链球菌3
‑
羟基
‑3‑
甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(mvaA)基因，所述嗜热链球菌3
‑
羟基
‑3‑
甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(mvaA)基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
[0022]进一步地，将重组乳酸菌在培养基中培养，培养基中加入乙酸。
[0023]进一步地，培养温度为30℃，ph为7.0，发酵时间为12h。
[0024]此外，本专利技术还提供一种基于上述方法得到的重组乳酸菌在制备益生菌产品或发酵剂中的应用，所述重组乳酸菌提高益生菌产品或发酵剂的抗氧化功能。
[0025]与现有技术相比，本专利技术通过构建一株产番茄红素的重组乳酸菌，测定自身和在脱脂乳中的抗氧化活性，发现重组乳酸乳球菌的抗氧化活性比出发菌株提高了1倍以上，且DPPH、ABTS和
·
OH自由基清除能力等显著增强，有望开发成为一种抗氧化的益生菌产品或发酵剂。
附图说明
[0026]图1为质粒构建过程；
[0027]图2为PCR验证和双酶切验证，其中，A为PCR验证，B为双酶切验证；
[0028]图3为电转入乳酸菌的转化子菌落PCR验证，其中，M为5000，1
‑
3均为转化子；
[0029]图4为发酵后菌体对比；
[0030]图5为发酵液萃取后HPLC分析结果，其中，A为lycopene标准品，B为NZ9000重组菌株发酵萃取液；
[0031]图6为lycopene UPC2分析结果；
[0032]图7为不同乙酸浓度对番茄红素生产的影响；
[0033本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高乳酸乳球菌抗氧化活性的方法，其特征在于，将crtE、crtB和crtI三个异源酶基因导入重组乳酸菌中，实现重组乳酸菌异源合成番茄红素，从而提高重组乳酸菌抗氧化活性；所述crtE异源酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述crtB异源酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述crtI异源酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。2.根据权利要求1所述的一种提高乳酸乳球菌抗氧化活性的方法，其特征在于，将pGZQ01质粒导入重组乳酸菌中，实现乳酸乳球菌异源合成番茄红素，从而提高乳酸乳球菌抗氧化活性，所述pGZQ01质粒中含有crtE、crtB和crtI三个异源酶基因，pGZQ01质粒的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。3.根据权利要求1所述的一种提高乳酸乳球菌抗氧化活性的方法，其特征在于，所述重组乳酸菌来源于敲除乳酸脱氢酶基因的乳酸乳球菌，所述乳酸脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。4.根据权利要求3所述的一种提高乳酸乳球菌抗氧化活性的方法，其特征在于，所述乳酸乳球菌为NZ9000。5.根据权利要求1所述的一种提高乳酸乳球菌抗氧化活性的方法，其特征在于，所述重组乳酸菌来源于...

【专利技术属性】
技术研发人员：艾连中，熊智强，夏永军，王光强，宋馨，张汇，
申请(专利权)人：上海理工大学，
类型：发明
国别省市：