检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的胶体金试纸条及其制备方法技术

本发明专利技术涉及快速免疫层析检测技术领域，具体涉及一种检测猪急性腹泻综合征冠状病毒胶体金试纸条及其制备方法。该胶体金试纸条包括PVC底板，样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次搭接在PVC底板上；硝酸纤维素膜上设有检测线T和质控线C。金标结合垫包被胶体金标记的抗SADS

【技术实现步骤摘要】
检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的胶体金试纸条及其制备方法


[0001]本专利技术涉及快速免疫层析检测
，具体涉及一种检测猪急性腹泻综合征冠状病毒胶体金试纸条及其制备方法。

技术介绍

[0002]SADS
‑
CoV是具有囊膜的单链RNA病毒，属于套式病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)，与HKU2高度相似，同源性高达90％，是一种新型蝙蝠冠状病毒。SADS
‑
CoV可导致仔猪严重急性腹泻和体重下降，造成严重的经济损失。
[0003]目前，SADS
‑
CoV的检测主要采用的技术方法有：病毒分离、免疫组化、免疫荧光、酶联免疫吸附试验(ELISA)或聚合酶链式反应(PCR)和实时定量PCR等方法。然而，这些方法比较耗时，需要专业的技术人员和特定的仪器才可以完成，很难满足临床样品的快速、廉价、高效监测的要求。
[0004]免疫层析法是近年来迅速发展的一项快速检测技术，具有简便、高效、成本低、污染小等特点，非常适合于大批量样品的现场筛查。免疫层析法有多种标记物可供选择，最为常用的是胶体金纳米粒子，胶体金纳米颗粒具有良好的稳定性，能够被长期保存可以依靠肉眼对信号进行读取识别，达到可视化检测的目的。由于操作简单、分析速度快、样品用量少、灵敏度高等优点，胶体金免疫层析技术已在各个领域广泛应用。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种可以快速检测SADS
‑
CoV病原检测的胶体金免疫层析试纸条，以对 SADS
‑
CoV病原进行高效监测从而控制该病的传播和流行，为猪急性腹泻综合征的防控提供技术支撑。
[0006]本专利技术具体包括以下内容：
[0007]第一方面，本专利技术提供了一种用于检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的胶体金试纸条，包括PVC底板、样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次搭接在PVC底板上；所述的硝酸纤维素膜上设有检测线T和质控线C，所述的检测线T设置于靠近金标结合垫的一端，所述的质控线C设置于靠近吸水垫的一端；所述金标结合垫包被有金标抗体，所述金标抗体为胶体金标记的抗SADS
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CoV N蛋白的单克隆抗体6E8；所述检测线T处包被有抗SADS
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CoV N蛋白的单克隆抗体6E8；所述质控线C处包被有兔抗鼠IgG。
[0008]优选地，所述金标结合垫的制备方法为：
[0009]将胶体金溶液的pH值调至8.0，在胶体金溶液中加入抗SADS
‑
CoV N蛋白的单克隆抗体6E8，37℃反应，再加入金标抗体封闭液，37℃反应，离心；用金标抗体保护剂将沉淀重悬，即得抗SADS
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CoV N蛋白的单克隆抗体6E8的金标抗体溶液；
[0010]将制备的金标抗体喷洒在结合垫上得金标结合垫；
[0011]所述抗SADS
‑
CoV N蛋白的单克隆抗体6E8采用公开号为CN113956353A的专利中的方法制备得到，单克隆抗体6E8的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示、轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
[0012]所述金标抗体封闭液为含有10％m/v BSA(纯度：99.8％)和0.5％m/v酪蛋白的超纯水溶液；
[0013]所述金标抗体保护剂为含有2％m/v BSA、5％m/v海藻糖、0.4％m/v PEG20000、0.5％v/vTween
‑
20的硼酸溶液。
[0014]优选地，所述SADS
‑
CoV N蛋白单克隆抗体6E8金标抗体溶液组成为：每1ml胶体金溶液含9.375μg SADS
‑
CoV N蛋白单克隆抗体6E8。
[0015]优选地，所述检测线T处包被有1mg/ml的SADS
‑
CoV N蛋白单克隆抗体6E8。
[0016]优选地，所述样品垫采用样品垫封闭液浸泡处理；所述样品垫封闭液为含有3％m/v海藻糖、1％m/v PEG20000、2％m/v BSA、1％m/v PVP
‑
40、0.5％v/v Tween
‑
20的硼酸溶液。
[0017]第二方面，本专利技术提供了一种上述检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的胶体金试纸条的制备方法，所述方法包括以下步骤：
[0018](1)制备包被有金标抗体的金标结合垫；
[0019](2)将抗SADS
‑
CoV N蛋白单克隆抗体6E8(1mg/ml)和兔抗鼠IgG抗体(0.5mg/ml) 间隔5～8mm喷在硝酸纤维膜上，分别作为检测线T和质控线C；
[0020](3)将样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次搭接在PVC底板上，得检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的胶体金试纸条。
[0021]第三方面，本专利技术试纸条的检测方法，其步骤如下：
[0022](1)待检样品的处理
[0023]A)细胞样品：将SADS
‑
CoV接种铺满单层的Huh7细胞，接毒60h后，置
‑
80℃冰箱反复冻融3次，12000rpm，4℃离心10min，去除细胞碎片，取上清作为被检抗原。取未接毒的Huh7细胞，以同样方法处理作为阴性对照。
[0024]B)肛拭子样品：收集肛试纸，加入1mlPBS，涡旋振荡，12000rpm，离心10min，收集上清。
[0025](2)样品检测
[0026]取10μL(1)中任一样品加入90μL样品稀释液进行稀释，滴入样品垫，5～10min内观察结果。所述样品稀释液为：0.02M Tris
‑
HCl(pH9.0)，0.85％m/v NaCl，1％v/v Tween
‑
20 的PBS溶液。
[0027](3)结果判定
[0028]阳性：检测线T和质控线C均出现紫红色条带；
[0029]阴性：只有质控线C出现紫红色条带；
[0030]无效：质控线C不出现紫红色条带；或者只有检测线T出现紫红色条带。
[0031]本专利技术的有益效果是：
[0032]本专利技术提供的检测SADS
‑
CoV的胶体金试纸条可用于SADS
‑
CoV病原的特异性检测，并且能区分临床症状相似的其他猪源肠道冠状病毒，如：TGEV、PEDV和PDCoV。试纸条能够检出培养物中病毒的最低限位10
3.69
TCID
50
/0.1mL。所制备的试纸条具有较好的特异性、灵敏
性、操作简单、时间短等优点，为猪急性腹泻综合征冠状病毒的现场或者实验室的检测提供了一种快速检测方法。
附图说明
[0033]图1最适抗体标记pH值选择结本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的胶体金试纸条，其特征在于，包括PVC底板、样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次搭接在PVC底板上；所述的硝酸纤维素膜上设有检测线T和质控线C，所述的检测线T设置于靠近金标结合垫的一端，所述的质控线C设置于靠近吸水垫的一端；所述金标结合垫包被有金标抗体，所述金标抗体为胶体金标记的抗SADS
‑
CoV N蛋白的单克隆抗体6E8；所述检测线T处包被有抗SADS
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CoV N蛋白的单克隆抗体6E8；所述质控线C处包被有兔抗鼠IgG。2.根据权利要求1所述的胶体金试纸条，其特征在于，所述金标结合垫的制备方法为：将胶体金溶液的pH值调至8.0，在胶体金溶液中加入抗SADS
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CoV N蛋白的单克隆抗体6E8，37℃反应，再加入金标抗体封闭液，37℃反应，离心；用金标抗体保护剂将沉淀重悬，即得抗SADS
‑
CoV N蛋白的单克隆抗体6E8的金标抗体溶液；将制备的金标抗体喷洒在结合垫上得金标结合垫；所述抗SADS
‑
CoV N蛋白的单克隆抗体6E8的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示、轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。3.根据权利要求1所述的胶体金试纸条，其特征在于，所述金标抗体封闭液为含有10% m/v BSA和0.5% m/v酪蛋白的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王琦，曹丽艳，万颖，郑海学，孔祥雨，张宇，李想通，段月月，袁聪，马国祥，
申请(专利权)人：中国农业科学院都市农业研究所，
类型：发明
国别省市：