一种可以显著提高野生型逆转录酶性能的方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学技术领域，尤其为一种可以显著提高野生型逆转录酶性能的方法，所述Sso7d结构域蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:1，所述sto7d结构域蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:2，所述野生型MMLV氨基酸序列为SEQIDNO.3，所述新型MMLV氨基酸序列为SEQIDNO.4，所述oligodt序列为SEQIDNO.5，所述Random序列为SEQIDNO.6，所述玉米上游引物序列为SEQIDNO.7，所述玉米下游引物序列为SEQIDNO.8。本发明专利技术通过将野生型MMLV氨基酸序列C端或者N端偶联sto7d或者sso7d结构域蛋白氨基酸序列，重新构建了一个新型逆转录酶Stowt。Sto7d或者sso7d的附着显著增强了野生型MMLV对温度、热稳定性和抑制剂的耐受性。热稳定性和抑制剂的耐受性。

【技术实现步骤摘要】
一种可以显著提高野生型逆转录酶性能的方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学
，具体为一种可以显著提高野生型逆转录酶性能的方法。

技术介绍

[0002]逆转录酶是生物技术中将RNA转化为cDNA的基础酶，这些酶构成了有价值的研究工具的基础，这些工具已被用于揭示生物体的许多基本过程，在分子诊断方面，这些酶是这类诊断的关键组成部分，从而促进了诊断和管理绝大多数疾病的新工具，例如癌症，然而，野生型MMLV逆转录温度较低，热稳定性较差，基因工程通过点突变或者分子进化得到的突变型的逆转录酶相对于野生型的MMLV具有较高的逆转录温度，较高的热稳定性性、较高的合成效率，然而无论是通过分子进化还是点突变都需要高通量的筛选方法和过程才能拿到具有特定功能的MMLV；
[0003]影响逆转录效率的一个因素是RNA形成二级结构的能力，例如，当RNA 分子的区域具有足够的互补性来杂交和形成双链RNA时，就可以形成这种二级结构，一般来说，通过提高含有RNA分子的溶液的温度，可以减少RNA二级结构的形成，因此，在许多情况下，37℃以上的温度下进行逆转录时更合适的，然而，当逆转录酶在37℃以时，活性通常会受到影响；
[0004]此外，提取核酸的生物样本通常含有抑制逆转录的其他化合物，例如，血液中的血红素，以及各种血液抗凝血剂，如肝素和柠檬酸，都是这类抑制剂，在核酸提取和纯化过程中，一些抑制剂可能不能被完全去除，从而对逆转录产生影响，本专利技术的逆转录酶就可以克服上述一些缺点。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于针对现有技术的不足之处，提供一种可以显著提高野生型逆转录酶性能的方法，以解决
技术介绍
中提出的问题。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种可以显著提高野生型逆转录酶性能的方法，所述Sso7d结构域蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，所述sto7d结构域蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，所述野生型MMLV氨基酸序列为SEQ ID NO.3，所述新型MMLV氨基酸序列为SEQ ID NO.4，所述oligodt序列为SEQ ID NO.5，所述Random序列为SEQ ID NO.6，所述玉米上游引物序列为SEQ ID NO.7，所述玉米下游引物序列为SEQ ID NO.8。
[0007]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述Stowt具有更强的热稳定性，37℃放置14天，不会影响cDNA合成效率。50℃ 7天不会影响cDNA合成效率。
[0008]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述Stowt具有广泛的抑制剂耐受性，包括肝素、SDS、胍盐和SDS等。
[0009]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述本专利技术提供了一种酶储存液，包含一种或多种缓冲溶液，KCl，EDTA、二硫苏糖醇(DTT)、甘油，此外还包含精氨酸或精氨酸衍生物及ET
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SSB，用于提高Stowt储存稳定性。
[0010]作为本专利技术的一种优选技术方案，所述本专利技术提供一种预混液，包含Tris 缓冲溶液、一价阳离子(例如钠离子、钾离子和锂离子)，二价阳离子(例如锰离子、镁离子和钙离子)，dNTPs和一些糖类(例如蔗糖，海藻糖、甘油)、还原剂(DTT)及表面活性剂(Tween
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20，NP
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40)等，用于cDNA合成。
[0011]一种可以显著提高野生型逆转录酶性能的方法，具体如下：
[0012]S1、提取核酸：新鲜的玉米嫩叶经预处理后，用商品化的病毒核酸提取试剂盒(济凡生物科技(常州)有限公司的“FinePure多糖多酚植物RNA提取试剂盒(货号R302)，进行提取，然后用Qubit
TM 4 Starter Packages荧光定量检测仪(Invitrogen货号Q33239)进行浓度检测，然后将用RNase
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free ddH2O进行稀释，稀释至待测浓度；
[0013]S2、逆转录温度测试：采用Thermo FIsher 5X第一链缓冲液(货号 28025013)配制反应体系，进行逆转录温度测定。5X第一链缓冲液4ul，Oligo dt(100μm)0.5ul，Random(100μm)0.5ul，dNTPs(10mM)1ul，RNasin(40U/ul) 1ul，野生型MMLV/StowtStowt 200U，模板RNA 2μl(1150pg、230pg、46pg)， RNase
‑
free H2O补足到20ul。然后用PCR仪(朗基T20型双槽梯度PCR仪) 进行反转录，cDNA合成效率用商品化的SYBR qPCR Master Mix(济凡生物科技(常州)有限公司的GenFQ SYBR qPCR Master Mix，货号A104)进行检测。使用SLAN
‑
96P进行荧光定量PCR检测，结果表明Stowt在37，42，50和65℃进行cDNA合成均不会受到影响，野生型与37℃相比，42，50和55℃下进行反转录cDNA的合成会受到影响；如表1所示，CT和荧光值都会受到影响；程序如表所示。
[0014][0015]S3、热稳定测试(37℃)：将野生型MMLV和Stowt置于37℃鼓风干燥箱 (上海捷呈实验仪器有限公司，货号DHG
‑
9075AE)，分别于0天、7天和14 天取样，取出后的样品置于冰箱中冷藏，然后同时进行检测，5X第一链缓冲液4ul，Oligo dt(100μm)0.5ul，Random(100μm)0.5ul，dNTPs(10mM) 1ul，RNasin(40U/ul)1ul，野生型MMLV/StowtStowt 200U，模板RNA 2μl (230pg、46pg、9.2pg)，RNase
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free H2O补足到20ul。然后用PCR仪(朗基T20型双槽梯度PCR仪)进行反转录，程序为25℃，5min，37℃，15min， 95℃，2min，cDNA合成效率用商品化的SYBR qPCR Master Mix(济凡生物科技(常州)有限公司的GenFQ SYBR qPCR Master Mix，
货号A104)进行检测。使用SLAN
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96P进行荧光定量PCR检测，经过14天的热稳定处理，RNA模板浓度从230pg
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9.2pg，Stowt的反转录活性并没有受到影响，且对下游的扩增也没有影响，而野生型MMLV cDNA合成效率显著降低；如下所示
[0016][0017]S4、热稳定测试(50℃)：将野生型MMLV和Stowt置于50℃鼓风干燥箱 (上海捷呈实验仪器有限公司，货号DHG
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9075AE)，分别于0天、3天和7天取样，取出后的样品置于冰箱中冷藏，然后同时进行检测，5X第一链缓冲液 4ul，Oligo dt(100μm)0.5ul，Random(100μm)0.5ul，dNTPs(10mM)1ul， RNasin(40U/ul)1u本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可以显著提高野生型逆转录酶性能的方法，其特征在于：所述Sso7d结构域蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，所述sto7d结构域蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，所述野生型MMLV氨基酸序列为SEQ ID NO.3，所述新型MMLV氨基酸序列为SEQ ID NO.4，所述oligo dt序列为SEQ ID NO.5，所述Random序列为SEQ ID NO.6，所述玉米上游引物序列为SEQ ID NO.7，所述玉米下游引物序列为SEQ ID NO.8。2.根据权利要求1所述的一种可以显著提高野生型逆转录酶性能的方法，其特征在于：所述Stowt具有更强的热稳定性，37℃放置14天，不会影响cDNA合成效率。50℃7天不会影响cDNA合成效率。3.根据权利要求1所述的一种可以显著提高野生型逆转录酶性能的方法，其特征在于：所述Stowt具有广泛的抑制剂耐受性，包括肝素、SDS、胍盐和SDS等。4.根据权利要求1所述的一种可以显著提高野生型逆转录酶性能的方法，其特征在于：所述本发明提供了一种酶储存液，包含一种或多种缓冲溶液，KCl，EDTA、二硫苏糖醇(DTT)、甘油，此外还包含精氨酸或精氨酸衍生物及ET
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SSB，用于提高Stowt储存稳定性。5.根据权利要求1所述的一种可以显著提高野生型逆转录酶性能的方法，其特征在于：所述本发明提供一种预混液，包含Tris缓冲溶液、一价阳离子(例如钠离子、钾离子和锂离子)，二价阳离子(例如锰离子、镁离子和钙离子)，dNTPs和一些糖类(例如蔗糖，海藻糖、甘油)、还原剂(DTT)及表面活性剂(Tween
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20，NP
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40)等，用于cDNA合成。6.根据权利要求1所述的一种可以显著提高野生型逆转录酶性能的方法的加工方法，具体如下：S1、提取核酸：新鲜的玉米嫩叶经预处理后，用商品化的病毒核酸提取试剂盒(济凡生物科技(常州)有限公司的“FinePure多糖多酚植物RNA提取试剂盒(货号R302)，进行提取，然后用Qubit
TM
4 Starter Packages荧光定量检测仪(Invitrogen货号Q33239)进行浓度检测，然后将用RNase
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free ddH2O进行稀释，稀释至待测浓度；S2、逆转录温度测试：采用Thermo FIsher 5X第一链缓冲液(货号28025013)配制反应体系，进行逆转录温度测定。5X第一链缓冲液4ul，Oligo dt(100μm)0.5ul，Random(100μm)0.5ul，dNTPs(10mM)1ul，RNasin(40U/ul)1ul，野生型MMLV/StowtStowt 200U，模板RNA 2μl(1150pg、230pg、46pg)，RNase
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free H2O补足到20ul。然后用PCR仪(朗基T20型双槽梯度PCR仪)进行反转录，cDNA合成效率用商品化的SYBR qPCR Master Mix(济凡生物科技(常州)有限公司的GenFQ SYBR qPCR Master Mix，货号A104)进行检测。使用SLAN
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96P进行荧光定量PCR检测，结果表明Stowt在37，42，50和65℃进行cDNA合成均不会受到影响，野生型与37℃相比，42，50和55℃下进行反转录cDNA的合成会受到影响；如表1所示，CT和荧光值都会受到影响；程序如表所示。
S3、热稳定测试(37℃)：将野生型MMLV和Stowt置于37℃鼓风干燥箱(上海捷呈实验仪器有限公司，货号DHG
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9075AE)，分别于0天、7天和14天取样，取出后的样品置于冰箱中冷藏，然后同时进行检测，5X第一链缓冲液4ul，Oligo dt(100μm)0.5ul，Random(100μm)0.5ul，dNTPs(10mM)1ul，RNasin(40U/ul)1ul，野生型MMLV/StowtStowt 200U，模板RNA 2μl(230pg、46pg、9.2pg)，RNase
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96P进行荧光定量PCR检测，经过14天的热稳定处理，RNA模板浓度从230pg
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9.2pg，Stowt的反转录活性并没有受到影响，且对下游的扩增也没有影响，而野生型MMLV cDNA合成效率显著降低；
S4、热稳定测试(50℃)：将野生型MMLV和Stowt置于50℃鼓风干燥箱(上海捷呈实验仪器有限公司，货号DHG
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9075AE)，分别于0天、3天和7天取样，取出后的样品置于冰箱中冷藏，然后同时进行检测，5X第一链缓冲液4ul，Oligo dt(100μm)0.5ul，Random(100μm)0.5ul，dNTPs(10mM)1ul，RNasin(40U/ul)1ul，野生型MMLV/StowtStowt 200U，模板RNA 2μl(1150pg、230pg、46pg)，RNase
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free H2O补足到20ul。然后用PCR仪(朗基T20型双槽梯度PCR仪)进行逆转录反应，程序为25℃，5min，37℃，15min，95℃，2min，cDNA合成效率用商品化的SYBR qPCR Master Mix(济凡生物科技(常州)有限公司的GenFQ SYBR qPCR Master Mix，货号A104)进行检测，使用SLAN
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96P进行荧光定量PCR检测，经过7天的热稳定处理，Stowt的反转录能力并没有受到影响，但是野生型反转录酶已经完全酶有活性；如表3所示。
S5、将野生型MMLV和Stowt置于37℃鼓风干燥箱(上海捷呈实验仪器有限公司，货号DHG
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9075AE)，分别于0天、7天和14天取样，取出后的样品置于冰箱中冷藏，然后同时进行检测；S6、5X第一链缓冲液4ul，Oligo dt(100μm)0.5ul，Ran...

【专利技术属性】
技术研发人员：牟新涛，刘婉君，王才宝，王凯，韩典森，
申请(专利权)人：济凡生物科技常州有限公司，
类型：发明
国别省市：