一种猪流行性腹泻亚单位疫苗及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种猪流行性腹泻亚单位疫苗及其制备方法和应用，属于疫苗制剂技术领域。本发明专利技术公开的亚单位疫苗包括：(1)S蛋白三聚体和药学上可接受的免疫佐剂；(2)S1蛋白三聚体和药学上可接受的免疫佐剂；(3)COEs三聚体和药学上可接受的免疫佐剂。本发明专利技术的亚单位疫苗免疫小鼠和仔猪后能够产生较高水平的IgG抗体和中和抗体滴度，淋巴细胞比例和淋巴细胞中IFN

【技术实现步骤摘要】
一种猪流行性腹泻亚单位疫苗及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及疫苗制剂
，具体涉及一种猪流行性腹泻亚单位疫苗及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)属于冠状病毒科冠状病毒Alphacoronavirus属，是猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)的病原体。该疾病具有发病快、传染性强、死亡率高的特点，并以急性水样腹泻、呕吐和脱水为主要症状。目前，PEDV在全球养猪业中仍普遍存在，严重影响畜牧业健康发展，使得PEDV等冠状病毒的致病机制及其防控成为研究人员关注的重点。
[0003]接种疫苗是目前防控PED的主要手段之一。目前市面上售卖的猪流行性腹泻疫苗主要都是传统的PEDV灭活疫苗和弱毒疫苗。PEDV灭活疫苗是通过加热或者化学试剂使PEDV活病毒失活并配合佐剂使用的一种疫苗。灭活疫苗安全性更高且易于产业化。但是，在病毒灭活过程中，抗原的免疫原性可能会有一定损伤，灭活疫苗存在免疫持续期短、需要多次免疫等局限，通常需要多次免疫。与灭活疫苗相比，减毒疫苗免疫原性更强，通常单次免疫就可产生足够的免疫保护。但是，减毒疫苗最大的危害是存在退化为野生型毒株的风险，因此限制了减毒疫苗的适用性。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种猪流行性腹泻亚单位疫苗及其制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，本专利技术提供的疫苗具有安全性高、免疫原性好、批次间稳定、生产成本低等优点，能够用于防治猪流行性腹泻。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0006]本专利技术提供一种重组猪流行性腹泻病毒亚单位疫苗，所述亚单位疫苗包括如下任一项所示的组合：
[0007](1)S蛋白和药学上可接受的免疫佐剂；
[0008](2)S1蛋白和药学上可接受的免疫佐剂；
[0009](3)COEs三聚体和药学上可接受的免疫佐剂。
[0010]进一步地，所述S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述S1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述COEs三聚体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0011]进一步地，所述免疫佐剂为M401佐剂，所述S蛋白、所述S1蛋白和所述COEs三聚体分别按照体积比1:1与所述M401佐剂混合制备亚单位疫苗；所述S蛋白、所述S1蛋白和所述COEs三聚体的浓度均为100μg/mL。
[0012]进一步地，所述免疫佐剂为M103佐剂，所述S蛋白、所述S1蛋白和所述COEs三聚体分别按照质量比1:1与所述M103佐剂混合制备亚单位疫苗；所述S蛋白、所述S1蛋白和所述COEs三聚体的浓度均为100μg/mL。
Buffer第2
‑
8ml；
[0028]图6是PEDV COEs蛋白纯化结果，a)为SDS
‑
PAGE验证图，b)为NGC色谱图，M是蛋白质分子质量标准，泳道1为细胞破碎后原液，泳道2为流穿液，泳道3
‑
4为20mM Binding Buffer第4ml和第5ml，泳道5
‑
7为100mM Binding Buffer第4
‑
6ml，泳道8
‑
14为500mM Elution Buffer第2
‑
8ml；
[0029]图7是用本专利技术实施例3的重组蛋白制备疫苗免疫后小鼠血清中IgG抗体检测结果；
[0030]图8是疫苗免疫后小鼠血清中和抗体效价检测结果；
[0031]图9是通过流式细胞术检测小鼠脾淋巴细胞CD3
+
CD4
+
T淋巴细胞亚型比例结果，其中A是PBS组，B是PEDV S/M103组，C是PEDV S/M401组，D是PEDV S1/M103组，E是PEDV S1/M401组，F是PEDV COEs/M103组，G是PEDV COEs/M401组；
[0032]图10是通过流式细胞术检测小鼠脾淋巴细胞CD3
+
CD4
+
T淋巴细胞亚型比例结果的柱状统计图；
[0033]图11是通过流式细胞术检测小鼠脾淋巴细胞CD3
+
CD8
+
T淋巴细胞亚型比例结果，其中A是PBS组，B是PEDV S/M103组，C是PEDV S/M401组，D是PEDV S1/M103组，E是PEDV S1/M401组，F是PEDV COEs/M103组，G是PEDV COEs/M401组；
[0034]图12是通过流式细胞术检测小鼠脾淋巴细胞CD3
+
CD8
+
T淋巴细胞亚型比例结果的柱状统计图；
[0035]图13是通过流式细胞术检测小鼠脾淋巴细胞B220
+
CD19
+
B淋巴细胞亚型比例结果，其中A是PBS组，B是PEDV S/M103组，C是PEDV S/M401组，D是PEDV S1/M103组，E是PEDV S1/M401组，F是PEDV COEs/M103组，G是PEDV COEs/M401组；
[0036]图14是通过流式细胞术检测小鼠脾淋巴细胞B220
+
CD19
+
B淋巴细胞亚型比例结果的柱状统计图；
[0037]图15是通过流式细胞术检测小鼠脾淋巴细胞CD3
‑
CD49b
+
NK淋巴细胞亚型比例结果，其中A是PBS组，B是PEDV S/M103组，C是PEDV S/M401组，D是PEDV S1/M103组，E是PEDV S1/M401组，F是PEDV COEs/M103组，G是PEDV COEs/M401组；
[0038]图16是通过流式细胞术检测小鼠脾淋巴细胞CD3
‑
CD49b
+
NK淋巴细胞亚型比例结果的柱状统计图；
[0039]图17是通过CCK
‑
8法检测小鼠脾淋巴细胞相对增值率的结果；
[0040]图18是小鼠细胞因子IFN
‑
γELISA检测结果；
[0041]图19是小鼠细胞因子IL
‑
4ELISA检测结果；
[0042]图20是用本专利技术实施例的重组蛋白制备疫苗免疫后仔猪血清中IgG抗体检测结果；
[0043]图21是疫苗免疫后仔猪血清中和抗体效价检测结果；
[0044]图22是通过CCK
‑
8法检测仔猪PBMC相对增值率的结果；
[0045]图23是仔猪细胞因子IFN
‑
γmRNA相对表达量的检测结果；
[0046]图24是仔猪细胞因子IL
‑
4mRNA相对表达量的检测结果；
[0047]图2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组猪流行性腹泻病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述亚单位疫苗包括如下任一项所示的组合：(1)S蛋白和药学上可接受的免疫佐剂；(2)S1蛋白和药学上可接受的免疫佐剂；(3)COEs三聚体和药学上可接受的免疫佐剂。2.根据权利要求1所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述S1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述COEs三聚体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。3.根据权利要求1所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述免疫佐剂为M401佐剂，所述S蛋白、所述S1蛋白和所述COEs三聚体分别按照体积比1:1与所述M401佐剂混合制备亚单位疫苗；所述S蛋白、所述S1蛋白和所述COEs三聚体的浓度均为100μg/mL。4.根据权利要求1所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述免疫佐剂为M103佐剂，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：李彬，范宝超，任丽莉，郭玮璐，李澧，宋旭，赵淑庆，张雪，钱嘉莉，郭容利，张雪寒，朱雪蛟，李基棕，周金柱，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：