一种用于SARS-CoV-2的可视化核酸检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术属于病毒检测技术领域，具体涉及一种用于SARS

【技术实现步骤摘要】
一种用于SARS
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CoV
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2的可视化核酸检测方法及试剂盒


[0001]本专利技术属于病毒检测
，具体涉及一种用于SARS
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CoV
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2的可视化核酸检测方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]新型冠状病毒(SARS
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CoV
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2，亦被称为2019
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nCoV、HCoV
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19)属于β属的冠状病毒，颗粒呈圆形或椭圆形直径60nm～140nm，基因特征与SARS具有明显的区别，且相比于SARS具有更高的感染能力。基于流行病学调查，COVID
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19的潜伏期为1～14天，多为3～7天，症状以发热、干咳、乏力为主，重症患者多在发病一周后出现呼吸困难和/或低氧血症，严重者可快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出现凝血功能障碍及多器官功能衰竭等。因此，如何快速确诊疑似病例，以及如何有效监控疾病进程，成为治疗COVID
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19，打好疫情攻坚战的重点。
[0003]SARS
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COV
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2的快速检测对当前世界上疫情的控制具有突出的贡献。目前市场上对2019
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Ncov的主要检测方法包括核酸检测，抗体和抗原检测。其中，核酸检测的一般步骤是：取样—提取核酸—反转录
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定量PCR，整个检测过程需要专业的仪器(全自动核酸提取仪，定量PCR仪)，专业的操作人员(操作步骤多)，平均耗时3小时以上才能拿到结果。
[0004]抗体检测主要是检测已经感染人员血液中的IgM和IgG，然而，抗体只有在感染几天之后才逐渐出现。抗原检测需要时间短，可以实现自主检测，但检测灵敏度有限。因此，有必要开发一种操作简单、无需专业仪器、灵敏度高，且耗时短的SARS
‑
COV
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2核酸检测方法。

技术实现思路

[0005]为了克服上述现有技术的不足，本专利技术一种基于环介导等温扩增原理的SARS
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COV
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2核酸检测方法(试剂或试剂盒)，能够直接使用咽拭子样品，无需提取核酸，一步加样操作，30分钟内特异性检测SARS
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COV
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2核酸。所需设备极度简化，只需要一个恒温加热装置，检测结果可以通过肉眼可分辨的颜色来判读。
[0006]为实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案来实现的：
[0007]本专利技术提供了一种用于SARS
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CoV
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2的可视化核酸检测试剂，所述试剂包括(NH4)2SO4，KCl，MgSO4，促核酸释放试剂，dNTP，SARS
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CoV
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2的N基因LAMP引物，Bst DNA聚合酶大片段，逆转录酶和显色试剂，所述显色试剂为pH或者镁离子响应的显色试剂。
[0008]作为本专利技术的一个优选实施方式，所述试剂共20～30μL，包含10mM(NH4)2SO4，50mMKCl，8mM MgSO4，0.2～1.0％促核酸释放试剂，2～20mMdNTP，6条0.1～1.6μM N基因LAMP引物，200～800ng/μLBst DNA聚合酶大片段，0.2～20ng/μL逆转录酶和0.2～0.6mg/mL显色试剂，所述显色试剂为间甲酚紫与偶氮氯膦Ⅲ的混合液，或者溴百里酚蓝与偶氮胂I的混合液。
[0009]优选地，所述显色试剂为0.2mg/mL间甲酚紫与0.2mg/mL偶氮氯膦Ⅲ的混合液，或者0.4mg/mL溴百里酚蓝与0.2mg/mL偶氮胂I的混合液。
[0010]优选地，所述N基因LAMP引物包括N gene引物组合，或ORF 1ab基因引物组合，或者人基因RPLP0引物组合，所述N gene引物组合如SEQ ID NO：1～6所示，所述ORF 1ab基因引物组合如SEQ ID NO：7～12所示，所述人基因RPLP0引物组合。
[0011]优选地，所述促核酸释放试剂包括Tween 20和CHAPS，所述Tween 20和CHAPS的用量比为1:1；所述逆转录酶为2
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8ng/μL AMV逆转录酶，或者5
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20ng/μL Tth DNA聚合酶，或者0.2
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0.8ng/μL HIV逆转录酶。
[0012]本专利技术还提供了一种用于SARS
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CoV
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2的可视化核酸检测试剂盒，所述试剂盒包括外套管和内套管，所述外套管预装有反应试剂，所述内套管预装有取样液，所述反应试剂包括Tris
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HCl，KCl，dNTP，N基因LAMP引物，Bst DNA聚合酶大片段，AMV逆转录酶，所述取样液包括(NH4)2SO4，KCl，MgSO4，Tween 20，CHAPS和显色试剂，所述显色试剂为间甲酚紫与偶氮氯膦Ⅲ的混合液，或者溴百里酚蓝与偶氮胂I的混合液。
[0013]作为本专利技术的一个优选实施方式，所述反应试剂为20μL，包括10mMTris
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HCl(pH 8.8)，300mMKCl，16mMdNTP，1μM～16μM的6条N基因LAMP引物，0.1μg/μLBst DNA聚合酶大片段，8ng/μL AMV逆转录酶；所述取样液为200
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300μL，包括10mM(NH4)2SO4，50mMKCl，8mM MgSO4，0.5％Tween 20，0.5％CHAPS和显色试剂，所述显色试剂包括0.2mg/mL间甲酚紫与0.2mg/mL偶氮氯膦Ⅲ的混合液，或者0.4mg/mL溴百里酚蓝与0.2mg/mL偶氮胂I的混合液。
[0014]优选地，所述内套管的上下管口通透，材质为聚丙烯，底部管口由2
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3mm厚度的固体石蜡密封，石蜡熔点为50
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60℃，预装取样液后用可撕开的密封膜将内套管上口密封，然后将密封后的内套管放入外套管，盖上盖子保存。
[0015]优选地，所述反应试剂和取样液可制备为冻干剂。
[0016]所述试剂盒的使用方法为：首先将样品管放置于恒温金属浴的EP管孔内，打开管盖，撕去密封膜；然后使用拭子取样，将取样的拭子在样品管的取样液中顺时针或逆时针搅拌15
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20圈；盖上盖子，启动金属浴，设置60～65℃开始反应；当温度达到设定温度，并反应20～30分钟后取出判读结果。
[0017]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0018]本专利技术提供了一种可视化、简易操作的核酸检测方法(试剂或试剂盒)，该方法基于环介导等温扩增的原理，在60
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65℃进行反应，然后通过样品颜色变化判断结果。该方法无需提取核酸，初始样品可以是取样的拭子，只需要一个恒温加热装置(金属浴，水浴)，一步加样，30分钟内即可判读结果，检测结果可本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于SARS
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CoV
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2的可视化核酸检测试剂，其特征在于，所述试剂包括(NH4)2SO4，KCl，MgSO4，促核酸释放试剂，dNTP，N基因LAMP引物，Bst DNA聚合酶大片段，逆转录酶和显色试剂，所述显色试剂为pH或者镁离子响应的显色试剂。2.根据权利要求1所述的一种用于SARS
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CoV
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2的可视化核酸检测试剂，其特征在于，所述试剂共20～30μL，包含10mM(NH4)2SO4，50mMKCl，8mM MgSO4，0.2～1.0％促核酸释放试剂，2～20mMdNTP，6条0.1～1.6μM N基因LAMP引物，200～800ng/μLBst DNA聚合酶大片段，0.2～20ng/μL逆转录酶和0.2～0.6mg/mL显色试剂，所述显色试剂为间甲酚紫与偶氮氯膦Ⅲ的混合液，或者溴百里酚蓝与偶氮胂I的混合液。3.根据权利要求2所述的一种用于SARS
‑
CoV
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2的可视化核酸检测试剂，其特征在于，所述显色试剂为0.2mg/mL间甲酚紫与0.2mg/mL偶氮氯膦Ⅲ的混合液，或者0.4mg/mL溴百里酚蓝与0.2mg/mL偶氮胂I的混合液。4.根据权利要求2所述的一种用于SARS
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CoV
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2的可视化核酸检测试剂，其特征在于，所述N基因LAMP引物包括N gene引物组合，或ORF 1ab基因引物组合，或者人基因RPLP0引物组合，所述N gene引物组合如SEQ ID NO：1～6所示，所述ORF 1ab基因引物组合如SEQ ID NO：7～12所示，所述人基因RPLP0引物组合。5.根据权利要求2所述的一种用于SARS
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CoV
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2的可视化核酸检测试剂，其特征在于，所述促核酸释放试剂包括Tween 20和CHAPS，所述Tween 20和CHAPS的用量比为1:1。6.根据权利要求2所述的一种用于SARS
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CoV
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2的可视化核酸检测试剂，其特征在于，所述逆转录酶为2
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8ng/μL AMV逆...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈耀庆，郑克威，吕可歆，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：