本发明专利技术公开了一种树突状细胞膜蛋白杂化的纳米疫苗的制备方法，包括如下步骤：S1：原代树突状细胞膜蛋白制备；S2：共载抗原多肽和光敏剂黑色素的羟基磷酸锌纳米粒制备；S3：优化树突状细胞膜蛋白量；S4：制备得到树突状细胞膜蛋白杂化纳米疫苗；可利用树突状细胞膜蛋白的同源靶向特性，实现树突状细胞对疫苗的高效捕获，结合近红外照射黑色素产生的温和光热，相对传统高热对免疫细胞的杀伤，温和光热既具有良好的生物安全性，又可诱导有效的抗肿瘤免疫应答。疫应答。疫应答。
【技术实现步骤摘要】
一种树突状细胞膜蛋白杂化的纳米疫苗的制备方法
[0001]本专利技术涉及纳米疫苗
，尤其涉及一种树突状细胞膜蛋白杂化的纳米疫苗的制备方法。
技术介绍
[0002]树突状细胞(dendritic cell,DC)具有启动、调控和维持特异性T细胞免疫应答的功能,在肿瘤免疫治疗中发挥着至关重要的作用。2010年美国食品药品监督管理局批准了人类历史上第一支树突状细胞疫苗Provenge，用于前列腺癌的治疗。然而，这种DC疫苗生产工序复杂，成本昂贵，一个治疗周期高达9.3万美元。
[0003]此外，DC在移植过程中易失活甚至死亡，导致真正到达淋巴部位的活性细胞偏少，限制了疫苗的临床效率。相较于体外产生的DC疫苗，具有免疫活性的亚单位疫苗可在体内将肿瘤抗原递送至DC以实现原位DC成熟，诱导持久高效的特异性T细胞应答。随着疫苗制备技术的进步，人们已能够通过生物或化学手段获取肿瘤特异性抗原多肽，它具有纯度高，无毒性或感染因子，无需胞内加工可直接被DC呈递等优点，利用纳米技术构建的载体系统可实现抗原多肽的有效装载，保护其在体内免受降解，延长多肽的半衰期，而将DC细胞膜蛋白引入纳米系统构建杂化体系，可利用细胞膜的同源靶向作用，促进DC捕获抗原，实现疫苗的精准递送。
[0004]DC捕获抗原后，需对抗原加工处理，并迁移至淋巴器官将抗原呈递给T细胞，近红外(near infrared，NIR)照射光敏剂后，相对于传统应用的高热(>42℃)对免疫细胞的杀伤，产生的温和光热(38～42℃)既显示了良好的生物安全性，又可促进抗原的加工处理以及向淋巴组织的回流。因此，实有必要研制新型的树突状细胞膜蛋白杂化纳米疫苗解决上述的技术问题。
技术实现思路
[0005]本专利技术的目的是提供一种树突状细胞膜蛋白杂化的纳米疫苗的制备方法，可利用树突状细胞膜蛋白的同源靶向特性，实现树突状细胞对疫苗的高效捕获，结合近红外照射黑色素产生的温和光热，相对传统高热对免疫细胞的杀伤，温和光热既具有良好的生物安全性，又可诱导有效的抗肿瘤免疫应答。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术提供一种树突状细胞膜蛋白杂化的纳米疫苗的制备方法，包括如下步骤：
[0007]S1：原代树突状细胞膜蛋白制备；
[0008]S2：共载抗原多肽和光敏剂黑色素的羟基磷酸锌纳米粒制备；
[0009]S3：优化树突状细胞膜蛋白量；
[0010]S4：制备得到树突状细胞膜蛋白杂化纳米疫苗。
[0011]优选的，步骤S2中所述的共载抗原多肽和光敏剂黑色素的羟基磷酸锌纳米粒制备过程具体为：
[0012]称取抗原多肽溶于Zn(NO3)2，制备成多肽储备液，取多肽储备液加入环己烷与Igepal CO
‑
520组成的油相中；
[0013]分别在油相中加入黑色素，并加入DOPA(二油酰基磷脂酸)，制备含药Zn相初乳；
[0014]Na2HPO4溶液中加入油相和二油酰基磷脂酸制备P相初乳，将P相初乳逐滴加入Zn相初乳中，室温反应，经无水乙醇破乳洗涤后，收集载药的磷脂包被羟基磷酸锌纳米粒，用氯仿重分散。
[0015]优选的，步骤S3中所述的优化树突状细胞膜蛋白的具体过程为：
[0016]将未载药的磷脂包被羟基磷酸锌纳米粒与二油酰磷脂酰胆碱、胆固醇和DSPE
‑
PEG2000一起旋膜除去氯仿；
[0017]将树突状细胞膜蛋白以不同蛋白/磷脂重量比加入磷酸缓冲盐中，将磷酸缓冲盐加入旋蒸瓶剧烈涡旋，水浴超声处理，恒温水浴孵育后，得到树突状细胞膜蛋白杂化羟基磷酸锌纳米粒；
[0018]将不同树突状细胞膜蛋白量得到的树突状细胞膜蛋白杂化羟基磷酸锌纳米粒。
[0019]优选的，步骤S4中所述的制备得到树突状细胞膜蛋白杂化纳米疫苗具体过程为：取多肽储备液加入环己烷与Igepal CO
‑
520组成的油相中，在油相中加入黑色素，并加入二油酰基磷脂酸，制备含药Zn相初乳；
[0020]在Na2HPO4溶液中加入油相和二油酰基磷脂酸制备P相初乳；30
‑
60分钟后，将P相初乳逐滴加入Zn相初乳中反应2
‑
3h，无水乙醇破乳洗涤后，高速离心收集载药的磷脂包被羟基磷酸锌纳米粒，用氯仿重分散，
[0021]将分散的载药磷脂包被羟基磷酸锌纳米粒与二油酰磷脂酰胆碱、胆固醇和DSPE
‑
PEG2000一起旋膜除去氯仿；
[0022]将树突状细胞膜蛋白以1:300的蛋白/磷脂重量比加入磷酸缓冲液中，再加入旋蒸瓶剧烈涡旋3
‑
5分钟，水浴超声处理3
‑
5分钟，37℃恒温水浴孵育30
‑
60分钟后，得到树突状细胞膜蛋白杂化纳米疫苗。
[0023]优选的，所述的二油酰磷脂酰胆碱、胆固醇、DSPE
‑
PEG2000三者的摩尔比为4：4：1。
[0024]优选的，步骤S2中所述的环己烷与Igepal CO
‑
520的体积比为71:29。
[0025]优选的，步骤S3中所述的水浴超声处理时间为3
‑
5分钟，恒温水浴孵育30
‑
60分钟。
[0026]优选的，步骤S4中所述的P相初乳逐滴加入Zn相初乳中反应2
‑
3h，旋蒸瓶剧烈涡旋的时间为3
‑
5分钟，水浴超声处理时间为3
‑
5分钟，恒温水浴孵育时间为30
‑
60分钟。
[0027]与现有技术相比，有益效果在于：本专利技术实施例提供的树突状细胞膜蛋白杂化的纳米疫苗将树突状细胞膜蛋白成功引入纳米体系，并成功共载抗原多肽和光敏剂黑色素，利用磷酸锌纳米粒的独特螯合作用，共载抗原多肽Adpgk和光敏剂黑色素，进一步在纳米粒表面引入树突状细胞膜蛋白杂化磷脂层；
[0028]该树突状细胞膜蛋白杂化的纳米疫苗可利用树突状细胞膜蛋白的同源靶向特性，实现树突状细胞对疫苗的高效捕获，结合近红外照射黑色素产生的温和光热，相对传统高热对免疫细胞的杀伤，温热诱导的免疫反应可有效抑制肿瘤生长，并显示了良好的生物安全性。同时，由于纳米粒的小尺寸效应，疫苗可直接回流至淋巴结，进一步增强抗肿瘤免疫应答。
附图说明
[0029]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0030]图1为载不同黑色素量的磷脂包被羟基磷酸锌纳米粒的形貌图。
[0031]图2为不同树突状细胞膜蛋白量得到的纳米疫苗的DSC曲线图。
[0032]图3为本专利技术实施例的树突状细胞膜蛋白杂化羟基磷酸锌纳米粒在透射电镜下的形貌图。
[0本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种树突状细胞膜蛋白杂化的纳米疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：原代树突状细胞膜蛋白制备；S2：共载抗原多肽和光敏剂黑色素的羟基磷酸锌纳米粒制备；S3：优化树突状细胞膜蛋白量；S4：制备得到树突状细胞膜蛋白杂化纳米疫苗。2.如权利要求1所述的树突状细胞膜蛋白杂化的纳米疫苗的制备方法，其特征在于，步骤S2中所述的共载抗原多肽和光敏剂黑色素的羟基磷酸锌纳米粒制备过程具体为：称取抗原多肽溶于Zn(NO3)2，制备成多肽储备液，取多肽储备液加入环己烷与Igepal CO
‑
520组成的油相中；分别在油相中加入黑色素，并加入二油酰基磷脂酸，制备含药Zn相初乳；Na2HPO4溶液中加入油相和二油酰基磷脂酸制备P相初乳，将P相初乳逐滴加入Zn相初乳中经无水乙醇破乳洗涤后，收集载药的磷脂包被羟基磷酸锌纳米粒，用氯仿重分散备用。3.如权利要求1所述的树突状细胞膜蛋白杂化的纳米疫苗的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述的优化树突状细胞膜蛋白量的具体过程为：将未载药的磷脂包被羟基磷酸锌纳米粒与二油酰磷脂酰胆碱、胆固醇和DSPE
‑
PEG2000一起旋膜除去氯仿；将树突状细胞膜蛋白以不同蛋白/磷脂重量比加入磷酸缓冲盐中，将磷酸缓冲盐加入旋蒸瓶剧烈涡旋，水浴超声处理，恒温水浴孵育后，得到树突状细胞膜蛋白杂化羟基磷酸锌纳米粒；将不同树突状细胞膜蛋白量得到的树突状细胞膜蛋白杂化羟基磷酸锌纳米粒。4.如权利要求1所述的树突状细胞膜蛋白杂化的纳米疫苗的制备方法，其特征在于，步骤S4中所述的制备得到树突状细胞膜蛋白杂化纳米疫苗具体过程为：取多肽储备液加入环己烷与Igepal CO
‑
520组成的油相中，在油相中加入黑色素，并加入二油酰基磷脂酸，制备含药Zn相初乳；在Na2HPO4溶液中加入油相和...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴婷婷，史琛，见晨，王璐璐，高辰，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。