积雪草组织培养快速繁殖方法技术

本发明专利技术公开了积雪草组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：1)取积雪草带腋芽茎段，消毒后，得到积雪草无菌外植体；2)利用诱导培养基培养积雪草无菌外植体，待外植体萌发后获得积雪草初代苗；3)利用增殖培养基培养积雪草初代苗，得到初代苗丛生芽；4)利用壮苗培养基培养初代苗丛生芽，得到积雪草健壮苗；5)利用生根培养基培养积雪草健壮苗，至根长2

【技术实现步骤摘要】
积雪草组织培养快速繁殖方法


[0001]本专利技术涉及组织培养
更具体地说，本专利技术涉及一种积雪草组织培养快速繁殖方法。

技术介绍

[0002]中药积雪草Centella asiatica(L.)Urb,为伞形科积雪草干燥全草，因其形似马蹄或半枚铜钱又称马蹄草、连钱草、崩大碗、钱如意等。是我国传统中药，拥有悠久的历史，最早记录于《神农本草经》，列为中品，中国药典亦有收载。其性辛、苦、寒，具有清热利湿、解毒消肿之成效，用于治疗湿热黄疸、中暑腹泻、石淋、血淋痈肿疮毒、跌打损伤等。积雪草属(Centella)植物，全世界约存在20多种，分布于南北半球热带和亚热带地区比较多，主产地于南非、印度、斯里兰卡等地，日本亦有分布，而在我国仅存积雪草1个品种，大量分布在华东、华南、中南及西南等地区。积雪草生长于海拔200～1990m的阴湿草地、田边、沟边，性喜阳光和比较湿润的环境，生性强健。
[0003]现代有临床研究结果表明，积雪草的成分可以有效镇痛，在抗肿瘤、抗微生物和免疫调节等方面也有着重要的作用等，其四季皆可采，新鲜用或者晒干。近年来其市场需求日益增加。但由于目前积雪草原料主要依靠采挖野生资源，而野生积雪草零散且植株小﹑生长慢﹑不容易采收，同时由于民间除草剂等农药的使用也导致积雪草资源减少，致使积雪草价格逐年上涨，野生积雪草资源面临濒临威胁，因此引种栽培、人工繁育等成为有效利用积雪草资源的新途径。近年来积雪草广泛地被科研以及临床上所应用，但研究者对其研究较多的是化学成分和药理作用研究方面居多，繁殖研究方面研究较少，仅有少量的利用其外植体进行组织培养扩繁的报道以及多倍体方面的报道，其中贺红等人公开了积雪草离体培养和快速繁殖方法探讨一文，研究表明在诱导培养积雪草带节茎段外植体时，使用0.5mg/L TDZ于诱导培养几种，可使不定芽诱导率达到最高的87.6％，而使用0.5mg/L BA则不定芽诱导率仅有26.8％，另外将植株生长良好、根系较多的积雪草试管苗移栽时，移栽成活率可达90％，显然，该技术中公开的积雪草组织培养从诱导分化出芽到最终获得移栽成活的积雪草成活苗的成功率较低，不足80％。另外，申请人在实验过程中发现，积雪草对TDZ比较敏感，在诱导培养时使用TDZ会在一定程度上影响积雪草初代苗的长势，甚至可能导致积雪草叶片出现皱缩的情况，对于积雪草组培苗生根后移栽的成活率有一定影响。
[0004]因此，建立一种更加高效的积雪草组织培养快繁体系，能提高积雪草组织培养快速繁殖的成功率，有利于高效获取大量积雪草无菌苗，具有广阔的市场应用前景。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种利用积雪草带腋芽茎段进行积雪草组织培养快速繁殖的方法，该方法能快速繁殖出大量适合移栽的优良积雪草种苗，满足市场需要。
[0006]为了实现本专利技术的目的和其它优点，提供了一种积雪草组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：
[0007]1)取积雪草带腋芽茎段，消毒后，得到积雪草无菌外植体；
[0008]2)利用诱导培养基培养积雪草无菌外植体，待外植体萌发后获得积雪草初代苗，诱导培养基中含1.5
‑
2.5mg/L的6
‑
苄氨基腺嘌呤，0.1
‑
1.0mg/L的激动素；
[0009]3)利用增殖培养基培养积雪草初代苗，得到初代苗丛生芽，增殖培养基中含0.05
‑
0.35mg/L的吲哚乙酸、0
‑
0.5mg/L的6
‑
苄氨基腺嘌呤、0.1
‑
1.0mg/L的激动素；
[0010]4)利用壮苗培养基培养初代苗丛生芽，得到积雪草健壮苗，壮苗培养基中含0.1
‑
0.5mg/L的6
‑
苄氨基腺嘌呤、0.1
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0.5mg/L的吲哚乙酸、0.2
‑
0.8g/L的活性炭；
[0011]5)利用生根培养基培养积雪草健壮苗，至根长2
‑
4cm，得到积雪草带根苗，生根培养基中含0.1
‑
0.5mg/L的吲哚乙酸、0
‑
0.5mg/L的萘乙酸、0.5
‑
1.0g/L的活性炭；
[0012]6)将积雪草带根苗经炼苗后移栽至基质中培养。
[0013]优选的是，所述的积雪草组织培养快速繁殖方法，诱导培养基、增殖培养基和壮苗培养基均采用MS培养基，生根培养基采用1/2MS培养基，诱导培养基、增殖培养基、壮苗培养基和生根培养基均含有5.0g/L的琼脂和30g/L蔗糖，pH值均为5.8。
[0014]优选的是，所述的积雪草组织培养快速繁殖方法，步骤2)中，培养温度为24
‑
26℃，光照强度为1500lux，光照时间为10
‑
12小时/天，培养15
‑
30天；步骤3)中，培养温度为24
‑
26℃，光照强度为2000lux，光照时间为10
‑
12小时/天，培养30天；步骤4)中，培养温度为24
‑
26℃，光照强度为2000lux，光照时间为10
‑
12小时/天，培养10
‑
21天；步骤5)中，培养温度为24
‑
26℃，光照强度为2000lux，光照时间为10
‑
12小时/天，培养21天。
[0015]优选的是，所述的积雪草组织培养快速繁殖方法，诱导培养基中含2mg/L的6
‑
苄氨基腺嘌呤，0.5mg/L的激动素；增殖培养基中含0.2mg/L的吲哚乙酸、0.25mg/L的6
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苄氨基腺嘌呤、0.5mg/L的激动素；壮苗培养基中含0.3mg/L的6
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苄氨基腺嘌呤、0.3mg/L的吲哚乙酸、0.5g/L的活性炭；生根培养基中含0.3mg/L的吲哚乙酸、0.25mg/L的萘乙酸、0.75g/L的活性炭。
[0016]优选的是，所述的积雪草组织培养快速繁殖方法，步骤2)中，诱导培养时间为15天，诱导培养中还含有0.1mg/L的灵发素与2mg/L的纳米氧化锌，光照培养时为白光与红蓝光交替环境下光照处理，先白光光照9小时/天，再红蓝光光照3小时/天，最后暗培养12小时/天，依次循环，其中红光与蓝光比为2:1。
[0017]优选的是，所述的积雪草组织培养快速繁殖方法，步骤4)中，壮苗培养时间为10天，壮苗培养基中还含有0.2g/L的水解酪蛋白与20μmol/L的茉莉酸甲酯，光照培养时为白光与红蓝光交替环境下光照处理，先白光光照8小时/天，再红蓝光光照4小时/天，最后暗培养12小时/天，依次循环，其中红光与蓝光比为2:3。
[0018]优选的是，所述的积雪草组织培养快速繁殖方法，步骤1)中消毒过程具体为：将积雪草带腋芽茎段依次用质量浓度为1％洗洁精水溶液浸泡5
‑
10min，自来水冲洗15
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.积雪草组织培养快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：1)取积雪草带腋芽茎段，消毒后，得到积雪草无菌外植体；2)利用诱导培养基培养积雪草无菌外植体，待外植体萌发后获得积雪草初代苗，诱导培养基中含1.5
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2.5mg/L的6
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苄氨基腺嘌呤，0.1
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1.0mg/L的激动素；3)利用增殖培养基培养积雪草初代苗，得到初代苗丛生芽，增殖培养基中含0.05
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0.35mg/L的吲哚乙酸、0
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0.5mg/L的6
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苄氨基腺嘌呤、0.1
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1.0mg/L的激动素；4)利用壮苗培养基培养初代苗丛生芽，得到积雪草健壮苗，壮苗培养基中含0.1
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0.5mg/L的6
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苄氨基腺嘌呤、0.1
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0.5mg/L的吲哚乙酸、0.2
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0.8g/L的活性炭；5)利用生根培养基培养积雪草健壮苗，至根长2
‑
4cm，得到积雪草带根苗，生根培养基中含0.1
‑
0.5mg/L的吲哚乙酸、0
‑
0.5mg/L的萘乙酸、0.5
‑
1.0g/L的活性炭；6)将积雪草带根苗经炼苗后移栽至基质中培养。2.如权利要求1所述的积雪草组织培养快速繁殖方法，其特征在于，诱导培养基、增殖培养基和壮苗培养基均采用MS培养基，生根培养基采用1/2MS培养基，诱导培养基、增殖培养基、壮苗培养基和生根培养基均含有5.0g/L的琼脂和30g/L蔗糖，pH值均为5.8。3.如权利要求2所述的积雪草组织培养快速繁殖方法，其特征在于，步骤2)中，培养温度为24
‑
26℃，光照强度为1500lux，光照时间为10
‑
12小时/天，培养15
‑
30天；步骤3)中，培养温度为24
‑
26℃，光照强度为2000lux，光照时间为10
‑
12小时/天，培养30天；步骤4)中，培养温度为24
‑
26℃，光照强度为2000lux，光照时间为10
‑
12小时/天，培养10
‑
21天；步骤5)中，培养温度为24
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26℃，光照强度为2000lux，光照时间为10
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12小时/天，培养21天。4.如权利要求3所述的积雪草组织培养快速繁殖方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：雷明，张占江，候小利，潘丽梅，韦树根，万凌云，谭桂玉，李翠，陈晓英，张坤，
申请(专利权)人：广西壮族自治区药用植物园，
类型：发明
国别省市：