一种利用液相色谱-串联质谱分析血浆样本中普瑞巴林浓度的方法技术

本发明专利技术提供了一种利用液相色谱

【技术实现步骤摘要】
一种利用液相色谱
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串联质谱分析血浆样本中普瑞巴林浓度的方法


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种利用液相色谱
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串联质谱分析血浆样本中普瑞巴林浓度的方法，该普瑞巴林用于治疗糖尿病性神经痛和带状疱疹神经痛。

技术介绍

[0002]普瑞巴林是神经递质γ
‑
氨基丁酸(GABA)的类似物，与中枢神经系统中α2
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δ位点(电压门控钙通道的一个辅助性亚基)有高度亲和力。普瑞巴林由Warner
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Lambert公司(现合并至辉瑞制药公司)开发，2004年获FDA批准用于治疗糖尿病性神经痛和带状疱疹神经痛，2005年9月在美国上市，普瑞巴林是美国和欧洲认可的第一个同时适用于治疗上述两种疼痛的药物。目前普瑞巴林已在欧洲、加拿大、墨西哥以及美国等40多个国家获准用于治疗神经性疼痛。为了加速其临床应用，需要一种简便、准确、快速、灵敏度高的生物分析方法。
[0003]目前，液相色谱
‑
串联质谱技术为分析人血浆中普瑞巴林的主要方法。黄洁等在2016年的普瑞巴林生物等效性研究中灵敏度也不够高。刘艳艳等人2017年开发了灵敏度较高的测定人血浆中普瑞巴林的方法，但是采用磺胺甲恶唑作为内标，并且样品预处理步骤繁琐，涡流需要两次，上清液需要过微孔滤膜，使用滤液进行分析，实验成本较高。徐凤华等人2017年开发了测定人血浆中普瑞巴林的方法，受试者血浆用量为200μL，分析时间6min，血浆用量多分析时间长，不适合大量临床样本分析，并且此方法的灵敏度不够高，最低定量限LLOQ为30.0ng/mL。
[0004]综上所述，现有技术中针对血浆样本中普瑞巴林的浓度检测方法无法兼顾灵敏度、分析速度，部分技术前处理操作复杂等。这些缺点不利于临床检测大批量血浆样本中普瑞巴林的浓度的准确分析。

技术实现思路

[0005]为了克服现有技术中的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种利用液相色谱
‑
串联质谱分析血浆样本中普瑞巴林浓度的方法。
[0006]本专利技术的目的通过以下技术方案得以实现：
[0007]一方面，本专利技术提供一种利用液相色谱
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串联质谱分析血浆样本中普瑞巴林浓度的方法，其包括如下步骤：
[0008]向血浆样本中加入内标溶液和乙腈进行涡流，离心后收集上清液，得到预处理后的待测样品；
[0009]采用液相色谱
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串联质谱检测，首先将待测样品进行液相色谱分离，然后进行质谱检测，基于检测峰面积比绘制标准曲线获得回归方程，最终计算获得待测样品中的普瑞巴林浓度。
[0010]上述的方法中，优选地，所述内标溶液为普瑞巴林
‑
d4(Pregabalin
‑
d4)。
[0011]上述的方法中，优选地，所述预处理的具体方法包括：
[0012]向96孔板中加入50.0μL血浆样本，接着加入50.0μL的内标溶液和300μL的乙腈，涡流混匀后离心收集上清液，并置于到另一干净96孔板中，得到待测样品。
[0013]上述的方法中，优选地，所述离心的时间为10min，离心温度为4℃，离心速度为3900rpm。
[0014]上述的方法中，优选地，所述内标溶液的浓度为500ng/mL。
[0015]上述的方法中，优选地，进行液相色谱分离所采用的色谱柱为：dC18色谱柱，3μm，4.6
×
100mm；所采用的流动相为：A相：含0.3％甲酸和10mM醋酸铵水溶液，B相：乙腈。
[0016]上述的方法中，优选地，进行液相色谱分离洗脱条件为：
[0017]梯度洗脱：
[0018]时间(min)流速(mL/min)流动相A/％流动相B/％0.00～0.600.775250.80～2.000.745552.10～3.000.77525
[0019]洗脱时间：3.00min；
[0020]进样量：5.00μL；
[0021]自动进样器温度：4℃；
[0022]柱温：40℃。
[0023]上述的方法中，优选地，进行质谱检测的质谱条件为：
[0024]离子源：电喷雾离子源(ESI)；
[0025]喷射电压：5000V；
[0026]喷雾气(Gas1)：45psi；
[0027]辅助气(Gas2)：45psi；
[0028]检测方式：正离子；
[0029]离子源温度：500℃；
[0030]碰撞诱导解离(CAD)：10psi；
[0031]气帘气(Curtain Gas)：25psi；
[0032]驻留时间：200ms。
[0033]上述的方法中，优选地，进行质谱检测采用定量分析离子对，所述定量分析离子对为：
[0034]普瑞巴林m/z 160.1
→
142.1，碰撞能量(CE)20eV，去簇电压(DP)50V；
[0035]普瑞巴林
‑
d4 m/z 164.2
→
146.1，碰撞能量(CE)20eV，去簇电压(DP)50V。
[0036]上述的方法中，优选地，标准曲线具体制作为：
[0037]以待测样品理论浓度为横坐标，待测样品与内标物的峰面积比为纵坐标，进行回归分析计算获得直线回归方程。
[0038]另一方面，本专利技术还提供上述的方法在分析血浆样本中普瑞巴林浓度中的应用；所述普瑞巴林用于治疗糖尿病性神经痛和带状疱疹神经痛。
[0039]本专利技术的有益效果：
[0040](1)本专利技术具有预处理操作简便的特点，仅需要一步提取即可进行分析，分析速度较快，分析时间仅为3min，因此本专利技术适合大批量临床研究样品分析。
[0041](2)本专利技术灵敏度较高，普瑞巴林定量下限为10.0ng/mL，柱上待测物的量按照稀释倍数8以及进样量5μL计算为6.25pg，本专利技术线性范围选择合理，能够更准确的分析药物的浓度。
[0042]上述说明仅是本专利技术技术方案的概述，为了能够更清楚了解本专利技术的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本专利技术的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
[0043]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0044]图1为普瑞巴林产物离子扫描质谱图；
[0045]图2为Pregabalin
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d4产物离子扫描质谱图；
[0046]图3为空白血浆样品中普瑞巴林的MRM色谱图；
[0047]图4为定量下限样品中普瑞巴林(左)和Pregabalin
‑
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种液相色谱
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串联质谱分析血浆样本中普瑞巴林浓度的方法，其包括如下步骤：向血浆样本中加入内标溶液和乙腈进行涡流，离心后收集上清液，得到预处理后的待测样品；采用液相色谱
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串联质谱检测，将待测样品进行液相色谱分离，然后进行质谱检测，基于检测峰面积比绘制标准曲线获得回归方程，最终计算获得待测样品中的普瑞巴林浓度。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述内标溶液为普瑞巴林
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d4。3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述预处理的具体方法包括：向96孔板中加入50.0μL血浆样本，接着加入50.0μL的内标溶液和300μL的乙腈，涡流混匀后离心收集上清液，并置于到另一干净96孔板中，得到待测样品；优选地，所述离心的时间为10min，离心温度为4℃，离心速度为3900rpm。4.根据权利要求1～3所述的方法，其中，所述内标溶液的浓度为500ng/mL。5.根据权利要求1所述的方法，其中，进行液相色谱分离所采用的色谱柱为：dC18色谱柱，3μm，4.6
×
100mm；所采用的流动相为：A相：含0.3％甲酸和10mM醋酸铵水溶液，B相：乙腈。6.根据权利要求5所述的方法，其中，进行液相色谱分离洗脱条件为：梯度洗脱：时间(min)流速(mL/min)流动相A/％流动相B...

【专利技术属性】
技术研发人员：马姣，姜金方，刘旭凌，谭文娟，潘婷，沃冬莹，
申请(专利权)人：苏州海科医药技术有限公司，
类型：发明
国别省市：