一种小鼠和人胚胎干细胞来源的类囊胚诱导培养液及小鼠和人的类囊胚诱导培养方法，利用化学成分明确的类囊胚诱导培养液，使小鼠/人的ESCs分化成自然囊胚所包含的三种不同细胞谱系，继续利用该类囊胚诱导培养液，将上一步获得的小鼠/人的含有三种不同细胞谱系的混合状态细胞，在悬浮培养的条件下诱导获得小鼠和人的类囊胚结构。本发明专利技术利用特定的类囊胚诱导培养液及诱导培养方法，使小鼠/人的ESCs自我组装产生类囊胚结构，通过实验手段验证了小鼠和人的类囊胚在形态、大小、细胞数量、细胞分布以及基因表达特征方面与自然囊胚相似，为体外组织形态发生、类器官建模和药物筛选等提供新的研究模型。新的研究模型。新的研究模型。
【技术实现步骤摘要】
小鼠/人胚胎干细胞来源的类囊胚诱导培养液及小鼠/人的类囊胚诱导培养方法
[0001]本专利技术属于胚胎干细胞培养
，特别涉及一种小鼠和人的类囊胚诱导培养液，尤其建立一种小鼠和人胚胎干细胞来源的类囊胚诱导培养方法。
技术介绍
[0002]胚胎干细胞(ESCs)起源于囊胚的内细胞团，可以贡献到胎儿所有组织中，但不参与胎盘发育。在合适的体外培养条件下，小鼠和人的ESCs能分化形成一种三维聚集体，称为胚状体(EBs)，它包含机体三种不同谱系细胞类型，可用来模拟早期胚胎发生研究。EBs的形成是ESCs自我组装和谱系分化的重要特征，然而EBs不能完全重塑胚胎发育的起始。
[0003]在过去的几年里，基于胚胎干细胞的类胚胎研究取得了突破性进展，一些研究报道了利用小鼠或人类胚胎干细胞体外重构获得囊胚或原肠期胚胎的发育模型。但是到目前为止，小鼠类囊胚的体外诱导仍需两种或三种不同类型的干细胞共同培养才能实现，而且培养条件非常复杂。能否只利用小鼠或人的胚胎干细胞，在化学成分明确的诱导培养条件下获得类囊胚结构，未见相关报道。
[0004]因此，获得一种简单高效的小鼠和人的类囊胚诱导培养液，尤其仅由小鼠和人胚胎干细胞来源的类囊胚诱导培养方法，是解决类囊胚体外诱导方法局限性的关键。
技术实现思路
[0005]本专利技术所要解决的技术问题是，提供一种小鼠和人胚胎干细胞来源的类囊胚诱导培养液，并建立类囊胚诱导培养方法，首次利用单一种类的胚胎干细胞系诱导培养获得大量的小鼠和人的类囊胚结构。
[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种小鼠/人胚胎干细胞来源的类囊胚诱导培养液，其特征在于：包括以下组分：每500ml类囊胚诱导培养液含CHIR99021的组成为：
[0007][0008]余量由基础培养液补充，
[0009]所述基础培养液为基础培养液DMEM/F12和基础培养液Neurobasal，二者体积比为1:1。
[0010]优选，每500ml类囊胚诱导培养液含CHIR99021的组成为：
[0011][0012]3一种小鼠/人胚胎干细胞来源的类胚胎诱导培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
[0013](1)准备含PD0325901+CHIR99021+LIF的2i/L培养液条件下培养的小鼠胚胎干细胞和mTeSR
TM
1培养液条件下培养的人胚胎干细胞，分别在37℃、5％ CO2浓度条件下培养。
[0014](2)取步骤(1)准备的1
×
105个小鼠/人ESCs分别利用类囊胚诱导培养液，在37℃、5％ CO2浓度条件下进行培养5
‑
7天，分别获得小鼠/人的含有囊胚三种类型细胞的混合细胞。
[0015](3)取步骤(2)得到的混合细胞1
×
105个，在37℃、5％ CO2浓度条件下利用类囊胚诱导培养液进行悬浮培养，每天更换诱导培养液，小鼠混合细胞在体外培养到3
‑
4天，或人的混合细胞在体外培养到6
‑
7天时开始形成小鼠和人的类囊胚结构。
[0016]本专利技术的有益效果是：
[0017](1)开发了一种简单的、化学成分明确的类囊胚诱导培养液，只用了一个因子CHIR99021，实现了小鼠/人的类囊胚体外诱导，培养条件非常简单。
[0018](2)利用该培养液，使小鼠和人的ESCs在体外自我组装获得类囊胚结构。
[0019](3)通过实验手段验证了小鼠和人的类囊胚在形态、大小、细胞数量、细胞分布以及基因表达模式方面与自然囊胚相似。
[0020](4)该专利技术为当前干细胞命运决定、早期胚胎发育、干细胞临床应用、再生医学和药物筛选等领域提供理想的研究模型。
附图说明：
[0021]图1是本专利技术中利用类囊胚诱导培养液培养小鼠ESCs后早期形态特征。
[0022]图2是本专利技术中利用类囊胚诱导培养液培养人ESCs后早期形态特征。
[0023]图3是本专利技术中小鼠胚胎干细胞来源的类囊胚诱导培养过程。
[0024]图4是本专利技术中人胚胎干细胞来源的类囊胚诱导培养过程。
[0025]图5是本专利技术中的小鼠类囊胚直径、总细胞数和内细胞团细胞数与自然囊胚之间比较结果。
[0026]图6是对本专利技术中获得的小鼠类囊胚结构进行的免疫荧光检测图，显示小鼠类囊胚包含自然囊胚所含三种细胞谱系的标志性蛋白的表达。
[0027]图7是对本专利技术中获得的人的类囊胚结构进行的免疫荧光检测图，显示人的类囊胚包含自然囊胚所含三种细胞谱系的标志性蛋白的表达。
具体实施方式
[0028]实施例1：小鼠/人的类囊胚诱导培养液的配制方法
[0029]一种小鼠/人胚胎干细胞来源的类囊胚诱导培养液，每500ml类囊胚诱导培养液含CHIR99021(WNT通路激活剂)的组成为：2
‑
3ml N2细胞培养添加剂、4
‑
6ml B27细胞培养添加剂、20
‑
30mg牛血清白蛋白、4
‑
6ml非必需氨基酸、4
‑
6ml左旋谷氨酰胺、0.5
‑
2mlβ巯基乙醇、4
‑
5ml青霉素链霉素、3.0μM CHIR99021、余量由基础培养液补充；所述基础培养液为基础培养液为DMEM/F12和基础培养液Neurobasal，二者体积比为1:1。
[0030]优选于，每500ml类囊胚诱导培养液含CHIR99021(WNT通路激活剂)的组成为：238.0ml基础培养液DMEM/F12、238.0ml基础培养液Neurobasal、2.5ml N2细胞培养添加剂、5.0ml B27细胞培养添加剂、25.0mg牛血清白蛋白、5.0ml非必需氨基酸、5.0ml左旋谷氨酰胺、1.0mlβ巯基乙醇、5.0ml青霉素链霉素、3.0μM CHIR99021。
[0031]实施例2：诱导小鼠/人胚胎干细胞来源的类囊胚的诱导培养方法
[0032]1.准备含PD0325901+CHIR99021+LIF的2i/L培养液在37℃、5％CO2浓度条件下培养的小鼠胚胎干细胞和mTeSR
TM
1培养液在37℃、5％CO2浓度条件下培养的人胚胎干细胞，上述两种细胞系的培养条件均为已知的；
[0033]2.把小鼠/人的ESCs向囊胚三种细胞谱系分化
[0034]从步骤1培养获得的小鼠或人的ESCs计数获取1
×
105个细胞，利用类囊胚诱导培养液，在37℃、5％ CO2浓度条件下进行贴壁培养；培养5
‑
7天后，可观察GOF/GFP标记的小鼠ESCs出现分化的迹象，即一部分绿色荧光蛋白逐步消失，传代过程用Acctase进行消化细胞，接种到纤维粘连蛋白处理的细胞培养皿中进行培养；培养5
‑
7天后，人的ESCs也开始出现分化现象，传代过程用EDTA(0.5本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种小鼠/人胚胎干细胞来源的类囊胚诱导培养液，其特征在于：包括以下组分：每500ml类囊胚诱导培养液含CHIR99021的组成为：余量由基础培养液补充，所述基础培养液为基础培养液DMEM/F12和基础培养液Neurobasal，二者体积比为1:1。2.根据权利1所述小鼠/人胚胎干细胞来源的类囊胚诱导培养液，其特征在于：每500ml类囊胚诱导培养液含CHIR99021的组成为：类囊胚诱导培养液含CHIR99021的组成为：3.一种利用权利要求1或2所述小鼠/人胚胎干细胞来源的类胚胎诱导培养方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)准备含PD0325901+CHIR99021+LIF的2i/L培养液条件下培养的小鼠胚胎干细胞和
mTeSR
【专利技术属性】
技术研发人员：吴宝江，包斯琴，王艳秋，李喜和，
申请(专利权)人：内蒙古大学，
类型：发明
国别省市：
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