一种物料保湿功效的体外评价方法技术

本发明专利技术提供一种物料保湿功效的体外评价方法，以人永生表皮细胞(HaCaT细胞)构建细胞模型，将参试物料作用于细胞模型，通过表征参试物料作用于细胞模型所引起细胞模型中保湿因子的含量变化量，以评价参试物料的保湿功效；其中保湿因子包括吡咯烷酮羧酸(PCA)、尿刊酸(UCA)中的至少一种。HaCaT细胞中的PCA含量和UCA含量的变化能够准确地反应物料的保湿作用情况，由此，本发明专利技术提供的物料保湿功效的体外评价方法能够对参试物料作用于人体皮肤的保湿效果作出准确、可靠的评价。可靠的评价。可靠的评价。

【技术实现步骤摘要】
一种物料保湿功效的体外评价方法


[0001]本专利技术属于检测
，具体地，涉及一种物料保湿功效的评价方法。

技术介绍

[0002]皮肤分为表皮、真皮、皮下组织及皮肤附属。表皮位于皮肤的最外层，由里到外分为基底层、棘层、颗粒层、透明层和角质层。最外面的角质层能有效阻止外界有害因素入侵人体和防止体内水分、营养物质流失。
[0003]保湿是皮肤护理的基础，研究者们也在不断的推出新的保湿功效验证方法。2020年发布的《化妆品保湿功效评价体外重组3D表皮模型测试方法》作为化妆品功效评价的团体标准，但此方法需要购买3D表皮模型，导致保湿功效检测的成本较高。专利CN108982716A和CN111289655A均公开了一种使用皮肤角质贴片测定保湿因子PCA、UCA的方法，但仅限于人体实验，对筛选物料具有一定的局限性。基于此，如何以简便、可靠、无损人体的方式了解物料的保湿功效，是本领域技术人员在研究中急需解决的问题。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种物料保湿功效的体外评价方法，以在无损人体组织的前提下，对物料的保湿功效进行可靠、准确的评估。
[0005]根据本专利技术的一个方面，提供一种物料保湿功效的体外评价方法，以人永生表皮细胞(HaCaT细胞)构建细胞模型，将参试物料作用于细胞模型，通过表征参试物料作用于细胞模型所引起细胞模型中保湿因子的含量变化量，以评价参试物料的保湿功效；其中保湿因子包括吡咯烷酮羧酸、尿刊酸中的至少一种。
[0006]角质层含水量的维持依赖于角质形成细胞基质中的天然保湿因子(natural moisturizing factor,NMF)，它们是存在于角质层内能与水结合的一些低分子量物质的总称，通过渗透压来吸引水分子，在角质层内与水结合而维持皮肤屏障功能。其中，吡咯烷酮羧酸(PCA)与尿刊酸(UCA)都是NMF的重要组成成分。人永生化表皮细胞系来源于表皮细胞，也称为表皮角质形成细胞系，它是由角质形成细胞培育而来的，是保留了角质形成细胞分化能力的永生细胞，且NMF存在于角质形成细胞的基质中。HaCaT细胞中的PCA含量和UCA含量的变化能够准确地反应物料的保湿作用情况，由此，本专利技术提供的物料保湿功效的体外评价方法能够对参试物料作用于人体皮肤的保湿效果作出准确、可靠的评价，其中，由于本专利技术采用HaCaT细胞构建细胞模型，HaCaT细胞已成为商业化细胞株，方便购买、质量稳定，较传统的人体实验方法，细胞实验受外界环境影响较小，能节省较多的人力资源，较3D表皮模型测试方法，本专利技术提供的体外评价方法所需成本更低，且易于操作。
[0007]优选地，上述物料保湿功效的体外评价方法包括如下步骤：细胞裂解步骤，使HaCaT细胞裂解以获得细胞裂解液；样品液制作步骤，对细胞裂解液进行总蛋白含量定量校正，以制得待测样品液样品；样品液检测步骤，检测待测样品液中的保湿因子的含量。在本专利技术中，通过对细胞裂解液进行总蛋白含量定量校正，目的是排除人为剥离组织的误差性，
℃。
[0022]本专利技术的有益效果在于：本专利技术是基于细胞水平的体外评价物料保湿功效的方法，区别于人体检测，操作方便简单、价格便宜、可重复性高。并且可以通过客观的科学数据直观反映被筛选物料的保湿功效，测定结果准确性高，通过测定皮肤中天然保湿因子的含量，评价物料的保湿功效，为企业开发有针对性的产品提供科学直观的数据支持。
附图说明
[0023]图1为本专利技术实施例2中BCA蛋白浓度标准曲线示意图；
[0024]图2为本专利技术实施例2中吡咯烷酮羧酸标准品(浓度为1μg/mL)色谱图；
[0025]图3为本专利技术实施例2中槐花样品和吡咯烷酮羧酸标准品(浓度为1μg/mL)拟合色谱图；
[0026]图4为本专利技术实施例2中顺式尿刊酸标准品(浓度为0.03μg/mL)、反式尿刊酸标准品(浓度为0.15μg/mL)色谱图；
[0027]图5为本专利技术实施例2中槐花样品和顺式尿刊酸标准品(浓度为0.03μg/mL)、反式尿刊酸标准品(浓度为0.15μg/mL)拟合色谱图；
[0028]图6为本专利技术实施例2中吡咯烷酮羧酸标准曲线示意图；
[0029]图7为本专利技术实施例2中反式尿刊酸标准曲线示意图；
[0030]图8为本专利技术实施例2中顺式尿刊酸标准曲线示意图。
具体实施方式
[0031]为了使本
的人员更好地理解本专利技术中的技术方案，下面将结合本专利技术实施例和实施例中的附图对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本专利技术保护的范围。
[0032]实施例1
[0033]1.实验材料、试剂
[0034]HaCaT人永生表皮细胞、DMEM培养基(Gibco，REF 11965
‑
092)、0.25％胰蛋白酶，含EDTA(Gibco，货号：25200072)、PBS(beyotime，C0221A)、吡咯烷酮羧酸(Sigma，货号：292915)、顺式
‑
尿刊酸(Sigma，货号：U6883)、反式
‑
尿刊酸(TCI，货号：I0002)、蛋白酶K(赛默飞，货号：AM2546)、RIPA裂解液
‑
强(碧云天，货号：P0013B)、蛋白酶抑制剂通用型100X(Biosharp，货号：BL612A)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天，货号：P0012S)、去离子水、甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)、六孔板(Corning，货号：3516)。
[0035]2.仪器与设备
[0036]高效液相，Alliance e2695、分析天平，Mettler
‑
Toledo、Vortex 3涡旋混合仪，IKA、Avanti J
‑
15R离心机，Beckman公司、10μL移液枪，GILSON、200μL移液枪，GILSON、1mL移液枪，GILSON、水浴锅、超声震荡仪、氮吹仪。
[0037]3.实验方法和步骤(1)细胞裂解步骤
[0038]S1.待HaCaT细胞长满六孔板70％时，将上述细胞放置在超净台下，在无风，温度
20
‑
25℃条件下暴露20min，建立干燥HaCaT细胞模型；
[0039]S2.取用HaCaT细胞模型中的干燥HaCaT细胞，并将其分为实验组和对照组，分别将作为实验组的干燥HaCaT细胞中加入含参试物料的DMEM培养基、将作为对照组的干燥HaCaT细胞加入无参试物料的DMEM培养基；
[0040]S3.胰酶消化后将上述细胞收集到5mL离心管中，1000rpm离心3min，吸弃上清；加入PBS重悬，洗涤细胞1次，1000rpm离心5min，吸弃上清；
[0041]S4.将上述细胞转移至冰上，每管加入20μL RI本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种物料保湿功效的体外评价方法，其特征在于，以人永生表皮细胞构建细胞模型，将参试物料作用于所述细胞模型，通过表征所述参试物料作用于所述细胞模型所引起所述细胞模型中保湿因子的含量变化量，以评价所述参试物料的保湿功效；其中所述保湿因子包括吡咯烷酮羧酸、尿刊酸中的至少一种。2.如权利要求1所述物料保湿功效的体外评价方法，其特征在于，包括如下步骤：细胞裂解步骤，使所述人永生表皮细胞裂解以获得细胞裂解液；样品液制作步骤，对所述细胞裂解液进行总蛋白含量定量校正，以制得待测样品液；样品液检测步骤，检测所述待测样品液中的所述保湿因子的含量。3.如权利要求2所述物料保湿功效的体外评价方法，其特征在于，在所述细胞裂解步骤中，裂解温度不高于0℃。4.如权利要求2所述物料保湿功效的体外评价方法，其特征在于，在所述细胞裂解步骤中，裂解液为添加有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，按照质量百分比计算，在所述RIPA裂解液中含有1％聚乙二醇辛基苯基醚、1％脱氧胆酸钠以及0.1％十二烷基硫酸钠。5.如权利要求2所述物料保湿功效的体外评价方法，其特征在于，所述样品液制作步骤包括以下操作：S1.对所述细胞裂解液进行总蛋白含量测定；S2.将所述细胞裂解液的总蛋白含量调节至预设值，得到总蛋白定量裂解液；S3.使所述总蛋白定量裂解液中的蛋白发生酶解，得到酶解混合物；S4.对所述酶解混合物进行分离纯化，并收集经过分离纯化后得到的上清液，以该上清液制备所述待测样品液。6....

【专利技术属性】
技术研发人员：李倩，郑嘉妮，徐捍山，
申请(专利权)人：仙乐健康科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：