一种酮还原酶催化制备（R）-苯乙醇的方法技术

本发明专利技术涉生物化学领域，具体涉及一种酮还原酶催化制备(R)

【技术实现步骤摘要】
一种酮还原酶催化制备(R)
‑
苯乙醇的方法


[0001]本专利技术涉生物化学领域，具体涉及一种酮还原酶催化制备(R)
‑
苯乙醇的方法。
技术背景
[0002](R)
‑
苯乙醇，也叫(R)
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(+)
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苯乙醇，英文名(R)
‑
(+)
‑1‑
Phenylethanol，CAS号：1517
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69
‑
7，分子结构式为：该分子拥有手性羟基，可用于合成抑制胆固醇吸收的药物，也被广泛用于化妆品，防腐剂和颜料的生产。
[0003]目前，(R)
‑
苯乙醇的合成方法主要有3种：(1)植物提取；(2)化学催化剂催化合成；(3)生物酶催化合成。植物提取由于分离纯化困难，且植物资源有限，限制了大规模生产；化学催化法使用钌、铱、铑等过渡贵金属元素，价格昂贵，回收困难。生物酶催化法具备资源充足、低成本、低污染、环境友好等优点。但现有报道的底物浓度低、转化率低、酶或细胞用量大，而底物和产物的沸点接近，分离困难。转化率低导致的底物大量残留加大了产品纯化的难度，阻碍了酶法催化制备(R)
‑
苯乙醇工艺的产业化应用。
[0004]因此，目前急需一种新的适于工业化应用的技术，实现高底物浓度、高转化率、低成本制备高光学纯度的(R)
‑
苯乙醇，以满足药物研发和生产方面的市场需求。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种酮还原酶催化制备(R)
‑
苯乙醇的方法，该方法能够通过高底物浓度制备得到高转化率、高光学纯度的(R)
‑
苯乙醇。
[0006]第一方面，本专利技术提供了一种酮还原酶催化制备(R)
‑
苯乙醇的方法，其包括以下步骤：
[0007]1)在液态反应体系中，以式II化合物苯乙酮为底物，在辅酶存在下，，在酮还原酶催化下，形式I化合物(R)
‑
苯乙醇；
[0008]2)任选地从所述步骤1)中的反应后的反应体系中分离出式I化合物R)
‑
苯乙醇；
[0009][0010]其中，所述酮还原酶选自下a)组或b)组：
[0011]a)来源于Lentilactobacillus rapi的野生型酮还原酶KRED的突变体，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；
[0012]b)对SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列在保持酶活性范围内，进行一个或多个氨基酸的替换、缺失、改变、插入或增加，所得到的至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的氨基酸序列。
[0013]在本专利技术的一种优选的实施方式中，所述反应体系中，底物式II化合物苯乙酮浓度为1
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50g/L，优选为12
‑
45g/L，更优选为24
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36g/L。
[0014]在本专利技术的一种优选实施方式中，所述辅酶选自下组：NAD+、NADP+、NADH或NADPH，更优选为NADP。
[0015]在本专利技术的一种优选实施方式中，所述辅酶的添加浓度为0.05
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1g/L，优选为0.2
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0.5g/L。
[0016]在本专利技术的一种优选的实施方式中，所述反应体系中，反应溶剂为异丙醇和水，所述异丙醇和水的体积比为1:0.11
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1.5,优选为1:0.25
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0.67。
[0017]在本专利技术的一种优选实施方式中，所述步骤1)中，反应温度为4
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37℃；优选地，反应温度为30
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35℃。
[0018]在本专利技术的一种优选实施方式中，所述步骤1)中，反应时间为18
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72小时；优选地，反应时间为18
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30小时。
[0019]在本专利技术的一种优选实施方式中，所述反应体系中，酮还原酶的存在形式为：酶粉(游离形式)、酶液、固定化酶、固定化细胞形式或菌体形式的酶。
[0020]进一步地，如采用游离形式的酶粉，所述酮还原酶浓度为4
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20g/L，优选为10
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15g/L。
[0021]进一步地，如果采用菌体形式或固定化细胞形式的酶，则酮还原酶细胞的使用浓度为30
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100g/L；优选使用浓度为60
‑
200g/L。
[0022]进一步地，如果采用菌体形式或固定化细胞形式的酶进行催化反应时，因为菌体形式或固定化细胞形式的酶制剂中含有少量辅酶，反应体系可以不另加辅酶；如以游离形式或固定化酶催化反应时，辅酶的添加浓度为0.05
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1g/L，优选为0.2
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0.5g/L。
[0023]本专利技术中所述酮还原酶为来源于Lentilactobacillus rapi的突变体，是通过对Lentilactobacillus rapi的酮还原酶进行突变并筛选得到。来源于Lentilactobacillu s rapi野生型酮还原酶在NCBI的登记号为WP_054748243.1，本专利的酮还原酶突变体氨基酸序列及其对应的基因序列均可通过商业化的全基因合成服务得到。
[0024]进一步，所述酮还原酶由基因工程菌发酵得到，所述基因工程可为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌，优选为大肠杆菌。
[0025]在本专利技术的一种优选实施方式中，所述步骤2)的分离步骤包括离心，取上清，有机溶剂萃取，无水硫酸钠干燥步骤。
[0026]在本专利技术的进一步优选实施方式中，所述有机溶剂选自乙酸乙酯、甲苯、四氢呋喃或氯仿，优选为乙酸乙酯。
[0027]第二方面，本专利技术提供前述酮还原酶的编码基因。
[0028]在本专利技术的一种优选实施方式中，所述酮还原酶的编码基因的核苷酸序列选自下组：
[0029]A):SEQ ID NO:1所示的序列；
[0030]B):与A)限定的序列互补的多核苷酸；
[0031]C):与A)限定的序列具有至少90％(优选至少90％、95％、96％、97％、98％、99％)以上的序列一致性的任一多核苷酸或互补序列。
[0032]第三方面，本专利技术提供一种表达载体，所述表达载体装载有前述所述的酮还原酶的编码基因。
[0033]在本专利技术的一种优选实施方式中，所述表达载体为重组质粒。
[0034]在本专利技术的一种优选实施方式中，所述表达载体为pET21a(+)载体。
[0035]第四方面，本专利技术还提供了一种基因工程菌，包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因，所述目的基因包含前述第二方面所述的酮还原酶的编码基因。
[0036]在本专利技术的一种优选实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌。
[0037]本专利技术提供一种酮还本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酮还原酶催化制备(R)
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苯乙醇的方法，其特征在于包括以下步骤：1)在液态反应体系中，以式II化合物苯乙酮为底物，在辅酶存在下，在酮还原酶催化下，形式I化合物(R)
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苯乙醇；2)任选地从所述步骤1)中的反应后的反应体系中分离出式I化合物R)
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苯乙醇；其中，所述酮还原酶选自下a)组或b)组：a)来源于Lentilactobacillus rapi的酮还原酶KRED的突变体，，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；b)对SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列在保持酶活性范围内，进行一个或多个氨基酸的替换、缺失、改变、插入或增加，所得到的至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％相同的氨基酸序列。2.如权利要求1中一种酮还原酶催化制备(R)
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苯乙醇的方法，其特征在于所述反应体系中，底物式II化合物苯乙酮浓度为1
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50g/L，优选为12
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45g/L，更优选为24
‑
36g/L。3.如权利要求1中一种酮还原酶催化制备(R)
‑
苯乙醇的方法，其特征在于所述辅酶选自下组：NAD+、NADP+、NADH或NADPH，更优选为NADP；所述辅酶的添加浓度为0.05
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1g/L，优选为0.2
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0.5g/L。4.如权利要求1中一种酮还原酶催化制备(R)
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苯乙醇的方法，其特征在于所述反应体系中，反应溶剂为异丙醇和水，所述异丙醇和水的体积比为1:0.11
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1.5,优选为1:0.25
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0.67。5.如权利要求1中一种酮还原酶催化制备(R)
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【专利技术属性】
技术研发人员：上官俊龙，洪静，
申请(专利权)人：浙江自贸区宝星生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：