一种TRPC5突变细胞株及其构建方法和应用技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其是涉及一种TRPC5突变细胞株及其构建方法和应用，所述TRPC5突变细胞株为TRPC5

【技术实现步骤摘要】
一种TRPC5突变细胞株及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种TRPC5突变细胞株及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]TRPC5是受体激活的非选择性阳离子通道，属于瞬时受体电位通道（TRP）家族中的经典型亚家族（TRPC），它是细胞膜上能通过钙离子的非选择性通道，TRPC5通道的激活将引起细胞膜去极化和胞质内钙浓度上升。
[0003]TRPC5通道主要表达于脑组织，在肝脏、肾脏等器官中也有一定程度的分布。此外，TRPC5介导多种生理过程，与恐惧、焦虑、抑郁等情绪的产生以及肾脏疾病密切相关。近期研究发现，TRPC5通道是治疗焦虑、抑郁和肾病的潜在药物靶点。
[0004]目前，对于TRPC5稳定细胞系的构建大多以TRPC5
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WT型进行构建，通过蛋白印迹实验筛选出TRPC5蛋白表达量较高的单克隆，后续使用表达量较高的此单克隆细胞，并基于手动膜片钳技术进行电生理学方法建立，记录内向电流及外向电流的大小。然而，基于手动膜片钳技术的检测方法存在低吞吐量，高成本，无法实现高通量低成本的药物筛选工作。
[0005]此外，基于荧光高通量检测的FLIPR钙流或膜电位非电生理筛选方法，也无较为成熟的报道。例如，运用瞬时转染TRPC5野生型过表达质粒的方法来进行FLIPR检测，可检测到膜电位的变化，但钙流信号及膜电位信号极低，无法进行药物筛选。
[0006]本专利技术针对全细胞膜片钳检测野生型TRPC5过表达细胞株电流过小，相关药物筛选难度大的问题，设计并构建了一种稳定过表达478T>C的TRPC5同义突变细胞株，进而增强全细胞膜片钳记录的离子通道电流，建立针对TRPC5靶点的高通量小分子药物筛选技术。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种TRPC5突变细胞株及其构建方法和应用，突变后的TRPC5通道基因可允许更多阳离子通过TRPC5通道进入细胞内，进而增强通过TRPC5通道的电流强度，有效改善了全细胞膜片钳检测电流小的问题，增加了FLIPR检测中钙流/膜电位信号强度，进而完善了TRPC5小分子抑制剂药物筛选方法。
[0008]第一方面，本专利技术提供一种TRPC5突变细胞株，所述TRPC5突变细胞株为TRPC5
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478T>C突变细胞株。
[0009]针对现有技术中野生型TRPC5稳定细胞株使用高通量的FLIPR钙流及膜电位试剂盒测试信号极低，无法实现药物筛选的问题。本专利技术提出了一种新型TRPC5
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478T>C突变细胞株，此位点突变为同义突变，不影响氨基酸序列，但可允许更多阳离子通过TRPC5通道进入细胞内，增强全细胞电流，改善全细胞膜片钳检测电流小的问题，并增加FLIPR检测中钙流/膜电位信号强度，进而可用于高通量TRPC5小分子抑制剂的筛选方法的建立，为快速确定局灶节段性肾小球硬化疾病小分子抑制剂候选药物的筛选奠定了基础。而基于为何此位点突变的TRPC5
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478T>C突变细胞株为何能够允许更多阳离子通过TRPC5通道进入细胞内，
尚在研究探索阶段。
[0010]第二方面，本专利技术还具体公开了上述TRPC5突变细胞株的构建方法，包括以下步骤：将TRPC5编码区碱基序列的第478位T突变为C，将突变后的序列构建到载体中，并通过脂质体转染的方法转到细胞中，经筛选得到TRPC5突变细胞株。
[0011]本专利技术首先根据TRPC5的编码区（coding sequence,CDS）碱基序列，将第478位碱基T突变为C。由于密码子的简并性，此位点突变为同义突变，不影响其所编码的氨基酸序列，但是研究表明，突变后的TRPC5
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478T>C突变细胞株可允许更多阳离子通过TRPC5通道进入细胞内，增强全细胞电流。
[0012]而在突变细胞株的构建过程中，本专利技术对于所使用的载体不作严格限定，具体载体可以为pcDNA3.1/Zeo(+)，该载体在多种哺乳动物细胞系中可实现高水平、组成型表达，并且其包含 Zeocin
™
可选标记物和正向多克隆位点。
[0013]将突变后的序列构建到载体中后，需要通过脂质体转染的方法转到细胞中，具体转染时，将构建好的TRPC5
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478T>C
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pcDNA3.1/Zeo(+)质粒通过脂质体转染的方法转到HEK293细胞中，于一定条件下培养1
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3天后，可得到多克隆细胞池。
[0014]培养得到的多克隆细胞需要进行筛选，以得到高表达并且能够激动出全细胞电流的单克隆细胞，因此，在筛选时，所使用的方法包括抗生素筛选和单克隆筛选。
[0015]作为本技术方案优选地，所述抗生素筛选时，在多克隆细胞池培养基中加入终浓度为80
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120 μg/mL的博莱霉素筛选4
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6天，筛选后的多克隆细胞进行稀释，分到96孔板中选择单个克隆细胞株进行扩大培养。
[0016]考虑在进行FLIPR钙流或膜电位方法建立时，需使用表达水平高且能激动出全细胞电流的单克基因，因此，在抗生素筛选后需要进行单克隆筛选，而单克隆筛选包括qRT
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PCR筛选和全细胞膜片钳法筛选。其中，qRT
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PCR筛选主要通过基因的表达水平筛选高表达的单克隆细胞，而全细胞膜片钳法筛选主要用于筛选能够激动出全细胞电流的单克隆。最后，对经过抗生素筛选和单克隆筛选后的单克隆细胞进行大量扩增并冻存。
[0017]第三方面，本专利技术还公开了上述TRPC5突变细胞株的应用，因此，上述TRPC5突变细胞株在药物筛选中的应用也理应属于本专利技术的保护范围。
[0018]上述TRPC5突变细胞株在药物筛选中的具体应用为基于TRPC5突变细胞株，通过全细胞膜片钳电生理方法和FLIPR钙流或膜电位非电生理方法，建立针对TRPC5靶点的高通量小分子药物筛选技术，进而完善TRPC5小分子抑制剂的药物筛选平台。
[0019]作为本技术方案进一步优选地，在所述FLIPR钙流或膜电位检测方法建立时，首先需要通过全细胞膜片钳方法验证TRPC5通道激动剂EC50和抑制剂IC50，筛选出验证结果与文献相符的单克隆细胞，而这里文献相符是指EC50和IC50与文献数据相差在三倍以内，表明其可以用于药物筛选的单克隆细胞，进而方可基于该单克隆细胞进行FLIPR钙流或膜电位方法的建立。
[0020]本专利技术的TRPC5
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478T>C突变细胞株，至少具有以下技术效果：1、本专利技术首先根据TRPC5的编码区（coding sequence,CDS）碱基序列，将第478位碱基T突变为C，由于密码子的简并性，此位点突变为同义突变，并不会影响氨基酸序列。但是，突变后的TRPC5通道基因可允许更多阳离子通过TRPC5通道进入细胞内，进而增本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种TRPC5突变细胞株，其特征在于，所述TRPC5突变细胞株为TRPC5
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478T>C突变细胞株。2.权利要求1所述TRPC5突变细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将TRPC5编码区碱基序列的第478位T突变为C，将突变后的序列构建到载体中，并通过脂质体转染的方法转到细胞中，经筛选得到TRPC5突变细胞株。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述载体为pcDNA3.1/Zeo(+)。4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述转染时，将构建好的TRPC5
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478T>C
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pcDNA3.1/Zeo(+)质粒通过脂质体转染的方法转到HEK293细胞中，经培养得到多克隆细胞。5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述筛选包括抗生素筛选和单克隆筛选。6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈兰兰，周芳宇，甄海燕，赵婷，张红，
申请(专利权)人：北京爱思益普生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：