一种双层琼脂平板法在微生物拮抗抑制检测上的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种双层琼脂平板法在微生物拮抗抑制检测上的应用，包括步骤（1）目标菌株接种至底层生长平板，形成菌斑；（2）上层倒制1

【技术实现步骤摘要】
一种双层琼脂平板法在微生物拮抗抑制检测上的应用


[0001]本专利技术涉及一种微生物拮抗抑制检测的应用，具体涉及一种双层琼脂平板法在微生物拮抗抑制检测上的应用。

技术介绍

[0002]微生物感染是最重要的致病原因之一，细菌、真菌、古细菌等都可能对人体健康带来威胁，抑制致病菌生长繁殖是人类对抗致病菌感染的最主要策略之一。益生菌是一类活的对人体有益的微生物，是近年非常活跃的研究热点，其作用机制，数十年来已有非常多的研究。其中，益生菌对致病菌的拮抗抑制作用，是其中最重要的机制之一。
[0003]在益生菌等微生物的拮抗作用研究过程中，双层平板点样法是较为常用的方法之一。首先将菌株培养液点样至底层生长平板上，待菌斑生长形成后，用含有指示致病菌悬液的半固体低浓度琼脂培养基，倒制上层琼脂平板，而后进行适当条件培养使指示菌形成菌落。目标菌株对致病菌的拮抗抑制作用的强弱，结果体现为上层琼脂平板形成的抑菌圈的大小。[Teixeira,G.S.,etal.2012CharacteristicsofLactobacillusandGardnerellavaginalisfromwomenwithorwithoutbacterialvaginosisandtheirrelationshipsingnotobioticmice.JMedMicrobiol61(Pt8):1074
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1081.]采用双层平板法，研究了作者所筛选到的菌株对多种致病菌的抑制作用，[WeiLI,XiaoXO,KeLI,etal.Screening,identificationandfermentationoptimizationofanantagonisticactinomycetestrainXL
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6againstRalstoniasolanacearum[J].MicrobiologyChina.]等应用双层平板法，筛选得到一株对青枯菌有强抑制作用的放线菌菌株XL
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6。[ShuL,Yi
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GuoHE,ZhaoXX,etal.IdentificationandCharacteristicofLacticAcidBacteriawithHighProductionofBacteriocinfromPitMudofStrong
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flavor[J].ScienceandTechnologyofFoodIndustry,2019.]用双层琼脂平板法从浓香型酒窖的窖泥中筛选出1株产细菌素的菌株，对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌以及部分乳酸菌有明显的抑制作用。
[0004]然而，双层琼脂平板法都采用上层琼脂倾注法，其特点是加样量较大，在加样、操作带来的误差来源较少。但是，在长期研究应用过程中发现其缺陷：1、菌落在倾注法平板的表面、内部、底部生长形成的菌落大小以及形态存在差别，生长在琼脂深层的菌落略小，且形态不规则，生长于平板表层的菌落大小及形态都比较一致[杨蕙,闫丽红,尹潇,等.比较倾注法与涂布法接种培养菌数的差异[J].中国消毒学杂志,2017,34(1):2.]。
[0005]2、对于兼性指示菌，在倾注法中上层平板表面的好氧条件、上层平板中间、底部的缺氧条件下，其代谢特征会有所不同。以糖代谢为例，好氧条件下糖进行TCA循环，消耗糖、氧气，产生二氧化碳、水。而缺氧条件下，可进行糖类乙醇发酵，消耗糖类，产生乙醇、二氧化碳。除此之外，菌体代谢整体特性不同，对不同抑制剂的敏感度也不同。这会导致有时平板表面抑菌圈明显，但抑菌圈区域内，平板内部不同深度还有很多细密的小菌落形成，从而对
实验造成严重影响。
[0006]3、冷冻食品的腐败与一些极限生长温度很低、甚至可达
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20℃的一些嗜冷微生物有关，一些嗜冷微生物在常温下易失活，当采用双层平板法研究有益微生物对其拮抗抑制作用时，若采用现有倾注法制作上层琼脂平板，由于倾注时琼脂菌悬液温度一般为45℃，远高于嗜冷微生物承受范围，导致极其容易导致其菌体生长活性丧失，从而导致实验失败。而采用本方面方法，可实现在更低温度条件下的接种，从而避免失败。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于针对现有技术的不足之处，提供一种双层琼脂平板法在微生物拮抗抑制检测上的应用：包括步骤（1）目标菌株接种至底层生长平板，形成菌斑；（2）上层倒制1
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3%琼脂含量的固体琼脂培养基；（3）待上层琼脂培养基凝固后，再于上层琼脂培养基表面进行指示菌液的涂布。
[0008]进一步的，所述底层生长平板，其配方选择实验中点样目标菌株适宜生长的培养基琼脂。
[0009]进一步的，所述上层琼脂培养基，选择适宜所选指示菌生长的培养基。
[0010]进一步的，包括：步骤（4）观测指示菌的生长和抑制情况。
[0011]进一步的，底层生长平板上的菌斑，接种方法采用划线、接种针接种、点样、穿刺 、微生物影印、自动涂布机、纸片法的方式进行接种；优选为点样。
[0012]在另一个实施方式中，上层琼脂培养基上的菌液的涂布，采用划线、接种针接种、点样、穿刺 、微生物影印、纸片法的方式进行替换。
[0013]在一个具体的实施方式中，指示菌为兼性厌氧菌，例如酵母。
[0014]在一个具体的实施方式中，指示菌为嗜冷菌。
[0015]本专利技术的有益效果：可以使得抑菌效果非常清晰的展示，减少误判。
附图说明
[0016]图1为实施例1的抑菌情况；图2为对比例1的抑菌情况；图3为实施例1的抑菌圈放大图；图4为对比例1的抑菌圈放大图。
具体实施方式
[0017]为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本专利技术的限定。
[0018]实施例1采用双层平板法研究某乳酸菌菌株对酿酒酵母的抑菌能力。选择添加1.5%琼脂粉的MRS培养基，倒制底层生长培养基，待其凝固后，吸取10ul待检验对象乳酸菌株培养液并点样至底层生长培养基表面，待其液体被吸收后倒置放于37℃恒温培养48h，形成菌斑。选择添加1.5%琼脂粉的SD培养基，倒制上层培养基，待其凝固后，移取100ul适当浓度的酿酒
酵母菌悬液至上层培养基表面，用涂布棒涂布均匀至液体被培养基吸收。倒置放于30℃恒温培养箱，培养24h
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48h。菌斑周围抑菌圈直径大小即可表征此乳酸菌菌株对此酿酒酵母菌株的拮抗抑制能力的大小。
[0019]对照例1采用双层平板法研究某乳酸菌菌株对酿酒酵母的抑菌能力。选择添加1.5%琼脂粉的MRS培养基，倒制底层生长培养基，待其凝固后，吸取10ul待检验对象乳酸菌株培养液并点样至底层生长培养基表面，待其液体被吸收后倒置放于37℃恒温培养48h，形成菌斑。选择添加1.5%琼脂粉的SD培养基，并移取100ul适当浓度的酿酒酵母菌悬液，混合均匀，倒制上层培养基，待其凝固后，倒置放于30℃恒温培养箱，培养24h
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种双层琼脂平板法在微生物拮抗抑制检测上的应用，其特征在于，包括：步骤(1)目标菌株接种至底层生长平板培养基，形成菌斑；(2)上层倒制1
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3％琼脂含量的固体琼脂培养基；(3)待上层琼脂培养基凝固后，再于上层琼脂培养基表面进行指示菌液的涂布。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述底层生长平板的培养基，选择点样目标菌株适宜生长的培养基琼脂。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述上层琼脂培养基，选择适宜所选指示菌生长的培养基。4.根据权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：任学良，褚晓洁，程晓月，徐安楠，李靖，
申请(专利权)人：南京北极光质检技术服务有限公司，
类型：发明
国别省市：