一种检测6种猪冠状病毒的RT-PCR检测方法技术

本发明专利技术属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测6种猪冠状病毒的RT

【技术实现步骤摘要】
一种检测6种猪冠状病毒的RT
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PCR检测方法


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种检测6种猪冠状病毒的RT
‑
PCR检测方法。

技术介绍

[0002]冠状病毒属于单股正链RNA病毒，分为α、β、γ和δ冠状病毒属。与SARS相比，猪、猫、狗和家禽等动物冠状病毒已在畜群和宠物中存在很长时间。目前有6种冠状病毒在猪群中传播，包括4种α冠状病毒：PRCV、TGEV、PEDV和SADS
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CoV，1种β冠状病毒(PHEV)和1种δ冠状病毒(PDCoV)。TGEV、PEDV、SADS
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CoV和PDCoV引起急性胃肠炎；PRCV引起呼吸道感染；PHEV会导致严重的神经和消化系统疾病。其中PHEV是唯一能够影响猪嗜神经的冠状病毒，感染后会引起猪呕吐、消瘦病(VWD)和脑脊髓炎等症状。TGEV是一种传染性强的猪冠状病毒，主要通过粪口途径传播。TGEV感染使肠绒毛萎缩，导致严重腹泻、呕吐、体重迅速减轻和死亡。PRCV是由TGEV变异而来，起源于TGEV S基因的5'端缺失，与TGEV相比病毒毒力和组织趋向性都发生了改变。PEDV是一种重要的猪肠道病毒，20世纪70年代初在猪群中传播，给美洲、欧洲和亚洲猪肉行业造成了重大经济损失。SADS
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CoV是另一种引起仔猪肠炎的猪α冠状病毒，与蝙蝠α冠状病毒HKU2CoV和菊头蝠属(Rhinolophus spp.)冠状病毒分别具有86％和96％以上的序列同源性，与HKU2CoV来自同一祖先。PDCoV于2012年在香港猪群中检测到，该病毒与鹌鹑δ冠状病毒UAE
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HKU30密切相关，起源于麻雀冠状病毒HKU15和鹌鹑冠状病毒HKU11之间通过鸟类和哺乳动物冠状病毒之间的宿主转换而发生的重组。
[0003]目前，猪的冠状病毒实验室诊断方法主要包括：病毒分离培养、免疫荧光、免疫组化、电子显微镜和聚合酶链反应(PCR)等。PCR技术是20世纪80年代中期发展起来的一种体外核酸扩增技术。它具有特异性强、重复性好、扩增效率高等优点，因此这项技术在生物医学领域具有划时代的意义。冠状病毒的早期快速诊断是控制疾病发展、监测病毒传播的重要手段。由于猪冠状病毒种类比较多，感染引起的临床症状相似，并且冠状病毒基因组具有高突变率，能够克服宿主物种障碍并适应新的宿主。因此快速检测猪源冠状病毒非常必要。
[0004]目前，PCR方法已被广泛用于诊断个体猪源冠状病毒感染，包括PCR、巢氏PCR、LAMP、基于SYBRGreenⅠ或TaqMan探针的荧光定量PCR方法等。例如，Li等建立了一种基于TGEV保守N基因的实时逆转录环介导等温扩增方法，用于快速诊断TGEV。Wang等开发了一种基于N基因的实时逆转录
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重组酶
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聚合酶扩增法进行PEDV检测。Zhou等设计了一种基于TaqMan的实时RT
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PCR检测方法，该方法基于病毒N基因内的保守区域可检测SADS
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CoV。Song等报告了一种基于PDCoV HKU15毒株N基因序列的PDCoV巢式RT
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PCR检测方法。此外，各种基于PCR的设计方法也被广泛用于诊断猪源肠道冠状病毒的混合感染。例如，Zhang等根据PEDV和PDCoV的M基因序列设计了两对引物，建立了两个单重RT
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PCR检测和一个双重实时RT
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PCR检测。Zhu等利用基于TGEV和PEDV的N基因序列设计的两对引物，建立了检测TGEV和PEDV的纳米颗粒相关PCR检测方法。
[0005]以上报道的检测方法主要针对单个病毒或2
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3个病毒进行检测，无法同时对6种冠
状病毒进行一次性同时检测。建立用于6种冠状病毒的高通量分子生物学检测方法，将极大地提高检测效率，节约检测成本。关于同时检测6种检测病毒的方法至今尚未见报道，更未见专门的RT
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PCR检测试剂盒。

技术实现思路

[0006]针对现有问题的不足，本专利技术的第一个目的是提供一种检测6种猪冠状病毒的引物对；
[0007]本专利技术的第二个目的是提供一种检测6种猪冠状病毒的检测试剂盒；
[0008]本专利技术的第三个目的是提供一种检测6种猪冠状病毒的RT
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PCR检测方法。
[0009]本专利技术根据猪源冠状病毒nsp12基因保守区域，设计了一对特异性引物，成功建立了RT
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PCR方法，可用于检测6种猪源冠状病毒，具有较高特异性和敏感性，对于冠状病毒监测具有重要意义。
[0010]本专利技术解决其技术问题采用的技术方案是：
[0011]第一方面，本专利技术保护一种检测/鉴定6种猪冠状病毒的引物对，该引物对为根据nsp12基因设计的引物对，包括引物SCOV
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F5和SCOV
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R5；其中，SCOV
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F5和SCOV
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R5序列如下：
[0012]SCOV
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F5：5'
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TTTTATGGTGGYTGGGA
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3',SEQ ID No:1；
[0013]SCOV
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R5：5'
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AAACAACGCCATCATCA
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3',SEQ ID No:2；
[0014]所述6种冠状病毒分别为猪流行性腹泻病毒(PEDV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪呼吸道冠状病毒(PRCV)和猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS
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CoV)，猪血凝性脑脊髓炎病毒(PHEV)和/或猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)。
[0015]为了快速检测猪源冠状病毒，本研究根据猪源冠状病毒nsp12基因保守区域，设计了一对特异性引物，成功建立了RT
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PCR方法，可用于检测6种猪源冠状病毒，具有较高特异性和敏感性，对于冠状病毒监测具有重要意义。
[0016]引物设计是进行PCR的第一步。PCR灵敏性要求DNA聚合酶能够对引物进行有效的扩增，PCR特异性要求引物能够与靶基因DNA特异性结合，即引物设计直接影响PCR扩增效率与特异性。引物设计的原则，主要是保证在扩增特异性和扩增效率之间取得平衡。本研究为了实现猪冠状病毒高通量检测，需要设计的引物能够同时检测6种猪冠状病毒。由于猪的6种冠状病毒分别属于α、β和δ三种属，所以首先分析比对了GeneBank数据库中的6种猪冠状病毒的全基因序列，采用Bioedit进行仔细比对分析，寻找出基因保守区域，然后使用Primer 5.0设计引物，设计了5对引物，通过在引物对中增加简并碱基来提高扩增效率。比较试验结果显示，5对引物均能扩增6种猪冠状病毒特异基因，其中，F5/R5引物扩增效率最高。
[0017]第二方面，本专利技术保护前文所述的引物对在如下(A1)...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测6种猪冠状病毒的引物对，其特征在于，该引物对包括引物SCOV
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F5和SCOV
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R5；其中，SCOV
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F5和SCOV
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R5序列如下：SCOV
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F5：5'
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TTTTATGGTGGYTGGGA
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3'，SEQ ID No:1；SCOV
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R5：5'
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AAACAACGCCATCATCA
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3'，SEQ ID No:2；所述6种冠状病毒分别为猪流行性腹泻病毒（PEDV）、传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪呼吸道冠状病毒（PRCV）和猪急性腹泻综合征冠状病毒（SADS
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CoV），猪血凝性脑脊髓炎病毒（PHEV）和/或猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）。2.权利要求1所述的引物对在如下（A1）
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（A6）中的任一所述的应用：（A1）制备用于鉴定6种猪冠状病毒的产品；（A2）鉴定6种猪冠状病毒；（A3）鉴定待测病毒是否为6种猪冠状病毒中的任一种或多种；（A4）制备用于鉴定待测病毒是否为6种猪冠状病毒的产品；（A5）检测待测样品中是否含有6种猪冠状病毒中的任一种或多种；（A6）制备用于检测待测样品中是否含有6种冠状病毒的产品。3.含有权利要求1所述的引物对的试剂盒，所述试剂盒的功能为如下（B1）
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（B3）：（B1）检测6种猪冠状病毒；（B2）检测待测病毒是否为6种猪冠状病毒中的任一种多种；（B3）检测待测样品中是否含有6种猪冠状病毒中的任一种多种。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有PCR扩增所需的其他试剂。5.一种鉴定待测病毒是否为6种猪冠状病毒的RT
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PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：以待测病毒的cDNA为模板，采用权利要求1所述的引物对进行扩增，得到扩增产物；若扩增产物中含有分子量大小为2772bp的条带，则所述病毒为PEDV病毒，若扩增产物中含有分子量大小为780bp的条带，则所述病毒为SADS病毒，若扩增产物中含有分子量大小为1007bp的条带，则所述病毒为TGEV病毒，若扩增产物中含有分子量大小为703bp的条带，则所述病毒为PRCV病毒，若扩增产物中含有分子量大小为663bp的条带，则所述病毒为PHEV病毒，若扩增产物中含有分子量大小为751bp的条带，则所述病毒为PDCoV病毒，若扩增产物中不含有分子量大小为2772bp的条带，不含有分子量大小为780bp的条带，不含有分子量大小为1007bp的条带，不含有分子量大小为703bp的条带，则所述病毒为PRCV病毒，不含有分子量大小为663bp的条带，不含有分子量大小为751bp的条带，则所述病毒不为6种猪冠状病毒；所述6种冠状病毒分别为猪流行性腹泻病毒（PEDV）、传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪呼吸道冠状病毒（PRCV）和猪急性腹泻综合征冠状病毒（SADS
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CoV），猪血凝性脑脊髓炎病毒（PHEV）和/或猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）。6.一种鉴别6种猪冠状病毒的RT
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PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：以待测病毒的cDNA为模板，采用权利要求1所述的引物对进行扩增，得到扩增产物；若扩增产物中含有分子量大小为2772b...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜平，梁霄，刘星，白娟，王先炜，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：