猪CTNS基因在促进动物骨骼肌生长中的应用制造技术

本发明专利技术公开了猪CTNS基因在促进动物骨骼肌生长中的应用。本发明专利技术根据人和小鼠的CTNS基因序列设计特异性引物，克隆得到了猪CTNS基因，并通过诱导表达得到了重组猪Cystinosin蛋白质。本发明专利技术通过等温滴定量热技术和分子对接分析，发现重组猪Cystinosin蛋白质和赖氨酸存在自发的中等强度结合，且无论是在体仔猪背最长肌还是离体肌卫星细胞中，Cystinosin蛋白质水平均响应赖氨酸浓度变化，并与V

【技术实现步骤摘要】
猪CTNS基因在促进动物骨骼肌生长中的应用


[0001]本专利技术属于分子生物学
更具体地，涉及猪CTNS基因在提高动物细胞蛋白质合成能力中的应用。

技术介绍

[0002]氨基酸感应的概念首次出现于1986年，但直到2015年，溶酶体膜蛋白质SLC38A9才被确认为mTORC1感应精氨酸的感应体。其后，Sestrin2被证明是亮氨酸的感应体；此为氨基酸功能研究领域里程碑式的事件，揭示了氨基酸为什么能激活mTORC1的机制。但随着研究深入，人们发现不同氨基酸激活mTORC1的途径不同。例如，有文章报道亮氨酸及其代谢产物均能激活mTORC1信号通路促进猪骨骼肌生长，但它们激活mTORC1的途径不尽相同。对于其他的氨基酸，如对动物生长最重要的赖氨酸，是如何被mTORC1感知的尚属空白，而对赖氨酸与mTORC1信号通路间的关系进行研究，有助于猪组织细胞中氨基酸感应功能的系统性研究，也有助于畜牧业精准营养调控猪骨骼肌生长。
[0003]目前，关于CTNS基因编码的Cystinosin蛋白质的研究多集中于胱氨酸贮积症，暂未见有关于Cystinosin蛋白质参与赖氨酸感应的报道。

技术实现思路

[0004]本专利技术要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足，填补赖氨酸是如何被mTORC1感知的空白，提供猪CTNS基因在促进动物骨骼肌生长中的应用。
[0005]本专利技术的第一个目的是提供猪CTNS基因在促进动物骨骼肌生长中的应用。
[0006]本专利技术的第二个目的是提供猪CTNS基因在提高动物细胞蛋白质合成能力中的应用。
[0007]本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：
[0008]本专利技术发现重组猪Cystinosin蛋白质(猪CTNS基因编码)与赖氨酸存在自发的中等强度结合，其能够响应赖氨酸的浓度变化，与V
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ATPase、RagC、Raptor和Rheb等蛋白质互作，从而调控mTORC1活性，促进猪骨骼肌卫星细胞蛋白质合成，促进猪骨骼肌生长。
[0009]因此，本专利技术申请保护猪CTNS基因在促进动物骨骼肌生长中的应用。
[0010]具体地，所述应用为猪CTNS基因编码的蛋白在介导mTORC1感应氨基酸促进动物骨骼肌生长中的应用。
[0011]具体地，所述氨基酸为赖氨酸。
[0012]具体地，所述动物为猪。
[0013]具体地，所述猪CTNS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0014]具体地，猪CTNS基因编码的蛋白质为Cystinosin蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0015]本专利技术还申请保护猪CTNS基因在提高动物细胞蛋白质合成能力中的应用。
[0016]具体地，所述应用为猪CTNS基因编码的蛋白在激活mTORC1通路提高动物细胞蛋白
I双酶切单酶切后纯化回收的pET
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32α
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CTNS质粒结果图，图c中M4为DNA Marker DL10000，3为含pET
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32α
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CTNS片段条带(6938bp)和pET
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32α片段(5900bp)。
[0034]图7为重组猪Cystinosin蛋白质(Recombinant pig Cystinosin protein,rpCystinosin)的纯化、验证结果；其中，图a为rpCystinosin蛋白质纯化后的考马斯亮蓝染色检测结果；图b为Cystinosin抗体验证结果；图c为His标签抗体验证结果，M5为Protein Marker 245。
[0035]图8为等温滴定量热(Isothermal titration calorimetry,ITC)技术检测赖氨酸和rpCystinosin的结合图；其中，图a为原始滴定图；图b为放热拟合曲线图。
[0036]图9为分子对接分析试验检测赖氨酸和Cystinosin蛋白质结合位点图。
[0037]图10为赖氨酸缺乏后补足处理的断奶仔猪背最长肌中氨基酸感应相关蛋白质和Cystinosin蛋白质表达水平检测结果；其中，图a为Western blotting试验条带；图b为条带统计结果图。
[0038]图11为不同浓度赖氨酸处理后骨骼肌卫星细胞蛋白质浓度、mTORC1信号通路、氨基酸感应相关蛋白质和Cystinosin蛋白质表达水平检测结果；其中，图a为不同浓度赖氨酸处理后骨骼肌卫星细胞蛋白质浓度；图b为mTOC1信号通路、氨基酸感应相关蛋白质和Cystinosin蛋白质Western blotting试验检测条带；图c为mTORC1信号通路条带统计结果图；图d为氨基酸感应相关蛋白质和Cystinosin蛋白质条带统计结果图。
[0039]图12为赖氨酸缺乏不同时间处理后骨骼肌卫星细胞蛋白质浓度、mTORC1信号通路、氨基酸感应相关蛋白质和Cystinosin蛋白质表达水平检测结果；其中，图a为赖氨酸缺乏不同时间处理后骨骼肌卫星细胞蛋白质浓度；图b为mTOC1信号通路、氨基酸感应相关蛋白质和Cystinosin蛋白质Western blotting试验检测条带；图c为mTORC1信号通路条带统计结果图；图d为氨基酸感应相关蛋白质和Cystinosin蛋白质条带统计结果图。
[0040]图13为赖氨酸刺激10min后骨骼肌卫星细胞蛋白质浓度，CTNS等溶酶体膜蛋白质mRNA丰度检测结果；其中，图a为赖氨酸刺激10min后骨骼肌卫星细胞蛋白质浓度；图b为溶酶体膜蛋白质CTNS、PQLC2、SLC38A9 mRNA丰度检测结果。
[0041]图14为赖氨酸刺激10min后骨骼肌卫星细胞mTORC1信号通路、氨基酸感应相关蛋白质和Cystinosin蛋白质表达水平及分布检测结果；其中，图a为mTOC1信号通路、氨基酸感应相关蛋白质和Cystinosin蛋白质Western blotting试验检测条带；图b为mTORC1信号通路条带统计结果图；图c为氨基酸感应相关蛋白质和Cystinosin蛋白质条带统计结果图；图d为免疫荧光染色检测骨骼肌卫星细胞中Cystinosin蛋白质分布图。
[0042]图15为免疫共沉淀试验探索与Cystinosin蛋白质互作的蛋白质检测图。
具体实施方式
[0043]以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。除非特别说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备为本
常规试剂、方法和设备。
[0044]除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0045]实施例1 PCR扩增猪CTNS基因ORF
[0046]1、引物设计
[0047]根据人CTNS基因序列(登录号为NM_001031681.2)和小鼠CTNS基因序列(登录号为NM_031251.4)的同源性，运用Primer Premier 5软件设计特异性本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.猪CTNS基因在促进动物骨骼肌生长中的应用。2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述应用为猪CTNS基因编码的蛋白在介导mTORC1感应氨基酸促进动物骨骼肌生长中的应用。3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述氨基酸为赖氨酸。4.根据权利要求1或2所述应用，其特征在于，所述动物为猪。5.根据权利要求1或2所述应用，其特征在于，所述猪CTNS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。6.猪CTNS基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：王修启，金成龙，叶茂，穆钊坤，高春起，严会超，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：