基于CHA的比率型荧光传感器检测OTA的检测方法及其应用技术

本发明专利技术提供了基于CHA的比率型荧光传感器检测OTA的检测方法及其应用，利用CDs和FAM作为双发射荧光探针结合CHA信号放大技术构建一种比率型荧光传感器，最终通过测定FAM荧光强度和CDs荧光强度的比值F

【技术实现步骤摘要】
基于CHA的比率型荧光传感器检测OTA的检测方法及其应用


[0001]本专利技术涉及生物传感
，尤其涉及基于CHA的比率型荧光传感器检测OTA的检测方法及其应用。

技术介绍

[0002]赭曲霉素A(Ochratoxin A，OTA)是一种由曲霉菌和青霉菌产生的具有免疫毒性、致畸性和致癌作用的真菌毒素，能污染谷物、大米、甘草以及葡萄酒等多种食物，对人类健康的威胁不容小觑。因此，有必要建立一种准确、灵敏的分析方法用于食品中OTA的检测。
[0003]荧光光谱法由于其简单、灵敏、便于同时检测等优点被广泛应用于检测行业。但是由于目标物低丰度、基体效应和方法灵敏度的限制，常规的荧光生物传感器难以实现对超痕量组分的准确检测。因此，采用信号放大技术提高检测的灵敏度是突破荧光生物传感器应用瓶颈的一个重要途径。目前，已报道的无酶参与的信号放大技术主要包括杂交链式反应（Hybridization chain reaction, HCR）、催化发卡自组装信号放大技术（Catalytic hairpin assembly, CHA）以及DNA步行者等，其中，CHA是一种通过发卡DNA循环组装而建立的无酶信号放大技术，引发链循环催化发卡底物组装，在每个级联反应后被释放出来，用于引发下一个循环反应。因此，基于CHA信号放大技术的荧光生物传感器被广泛用于DNA、RNA、蛋白质、金属离子以及生物小分子的检测中。
[0004]尽管信号放大技术可以提高荧光传感器的灵敏度，但是复杂样品的基体干扰以及假阳性问题仍然限制了荧光传感器的应用，荧光传感器的准确性受到限制。如专利“专利号CN 106370638 B”公开一种用于Hg
2+
检测的比色、荧光双信号生物传感器及检测方法，基于催化发卡组装无酶放大技术构建了比色
‑
荧光双信号生物传感器，虽然兼具比色法便利和荧光法灵敏度高的优点，但是也存在复杂样品的基体干扰以及假阳性问题，检测结果易出错。专利“专利号CN 114113264 A”公开一种基于EXOⅢ辅助链循环和CHA反应的妥布霉素双放大检测方法和应用，但该传感器在诱导CHA反应时使用的蛋白酶易受环境影响，在很大程度上增加了该方法的操作条件要求和成本，同时也对检测结果的准确性产生不利影响，限制了该方法的应用。
[0005]同时，目前关于构建生物传感器实现OTA检测的研究尚在发展中，专利“专利号CN 109884009 A”公开了一种目标物介导的荧光比率型传感器检测赭曲霉素A的检测方法，但其核酸信号微弱，荧光传感器的灵敏度有限；专利“专利号CN 111424072 A”公开了一种检测赭曲霉毒素A的电化学生物传感器及其制备方法，但检测限仅能达到100 ng/mL，难以实现对赭曲霉素A的超痕量检测。因此，克服上述现有技术所存在的缺陷，提供一种简单便捷、快速且高灵敏度的检测OTA的方法，是目前OTA检测应用中亟待解决的问题。

技术实现思路

[0006]针对现有检测方法检测OTA时灵敏度、精确度较差及超痕量难以检测的技术问题，本专利技术提出基于CHA的比率型荧光传感器检测OTA的检测方法及其应用。
[0007]针对上述目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：基于CHA的比率型荧光传感器检测OTA的检测方法，步骤如下：（1）取20 mL浓度为1 mmol/L的氯金酸溶液(HAuCl4·
4H2O) 于50 mL二颈圆底烧瓶中，加热至120℃，后迅速加入2 mL浓度为38.8 mmol/L的柠檬酸钠溶液，继续加热并搅拌15 min后冷却回流至室温，最后用0.45 μm的尼龙滤膜过滤收集滤液，即得金纳米粒子（AuNPs）的平均粒径为13 nm、浓度为11.5 nM的AuNPs溶液，储存在4℃的冰箱内待用。制备过程中用到的玻璃仪器使用前均需用王水（V
HCl
：V
HNO3 = 3：1）浸泡30 min，再用超纯水冲洗干净。
[0008]（2）取4 mL步骤（1）的AuNPs溶液，向其中加入60 μL发卡探针H1（浓度10 μM）的醋酸盐缓冲溶液（pH：5），再加入10 μL浓度为20 mM的TCEP（购自西格玛
‑
奥尔德里奇有限公司(中国上海)），在室温下孵育16 h，然后在接下来的44 h内向混合溶液中缓慢加入浓度为1 M的NaCl溶液，直至最终溶液中NaCl的浓度为0.1 M，将所得溶液在15000 rpm的转速下离心三次，每次离心的时间均为30 min，以除去未修饰到AuNPs表面的DNA，收集离心后的红色溶胶，即得发卡探针H1修饰的AuNPs探针，即H1‑
AuNPs。
[0009]（3）取浓度均为100 μM的EDC和NHS各100 μL进行混合，向其中加入5 mL浓度为1 mg/L的CDs溶液，室温下搅拌30min以活化羧基，然后加入20 μL发卡探针H2的缓冲溶液，在室温下继续搅拌24 h，即得发卡探针H2修饰的CDs，即H2‑
CDs，浓度为100 μM，储存在4℃的冰箱内待用。
[0010]（4）分别取10 μL浓度均为100 μM的适配体AP和辅助探针HP，在室温下杂交获得最初反应液，然后向其中加入待测样品室温孵育40min，然后加入100 μL步骤（2）的H1‑
AuNPs，室温反应45 min，再加入10 μL步骤（3）的H2‑
CDs室温反应60 min，最后将混合物离心，除去未反应的溶液，稀释至500 μL得到待检测的混合物。将待检测的混合物在360 nm激发波长下进行荧光检测。
[0011]（5）将步骤（4）测得的FAM荧光强度和CDs荧光强度的比值代入线性方程F
FAM
/F
CDs = 4.43 c+ 0.46，经计算得到c值，即得待测样品的OTA的浓度。所述c的单位为ng/mL。
[0012]进一步的，所述步骤（2）中发卡探针H1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其5
’
端修饰有巯基、3
’
端修饰有FAM基团。
[0013]进一步的，所述步骤（3）中发卡探针H2的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，其5
’
端修饰有氨基。
[0014]进一步的，所述步骤（4）中适配体AP的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；辅助探针HP的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
[0015]上述基于CHA的比率型荧光传感器检测OTA的检测方法在检测OTA中的应用，所述检测OTA的线性范围为5.0 pg/mL
‑
3.0 ng/mL，检出限为1.5 pg/mL。
[0016]本专利技术的有益效果：本专利技术提供了基于CHA的比率型荧光传感器检测OTA的检测方法及其应用，利用CHA信号放大技术提高传感器的灵敏度，同时无需使用蛋白酶等酶类，外界环境影响更小，实验条件要求更低，通过简便的操作即可实现传感器较高的准确度；同时构建比率荧光传感器，通过建立内标，以双信号比值处本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于CHA的比率型荧光传感器检测OTA的检测方法，其特征在于，步骤如下：（1）利用柠檬酸钠溶液还原氯金酸溶液制备AuNPs溶液；（2）将发卡探针H1溶于醋酸盐缓冲溶液中，再加入TCEP，所得溶液加至步骤（1）的AuNPs溶液中，室温孵育，然后分批加入NaCl 溶液，离心去除上清，即得发卡探针H1修饰的AuNPs探针，即H1‑
AuNPs；（3）将EDC和NHS的混合液加入到CDs溶液中，室温搅拌，然后加入发卡探针H2，继续室温搅拌，得发卡探针H2修饰的CDs，即H2‑
CDs；（4）将适配体AP与辅助探针HP在室温下杂交获得最初反应液，然后加入待测样品，室温孵育后加入步骤（2）的H1‑
AuNPs，反应一段时间，再加入步骤（3）的H2‑
CDs，离心除去反应液，所得沉淀经稀释后，进行荧光检测；（5）将步骤（4）测得的FAM荧光强度和CDs荧光强度的比值代入线性方程F
FAM
/F
CDs = 4.43 c + 0.46，求得c值，即得待测样品的OTA的浓度。2.根据权利要求1所述的基于CHA的比率型荧光传感器检测OTA的检测方法，其特征在于：所述步骤（1）AuNPs溶液中AuNPs的直径小于0.45 μm，AuNPs的浓度为11.5 nM。3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于：所述步骤（2）中发卡探针H1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其5
’
端修饰有巯基、3
’
端修饰有FAM基团。4.根据权利要求3所述的基于CHA的比率型荧光传感器检测OTA的检测方法，其特征在于：所述醋酸盐缓冲溶液中发夹探针H1的浓度为10 μM，醋酸盐缓冲溶液的pH为5、体积为60 μL；TCE...

【专利技术属性】
技术研发人员：张红，苗向敏，贺帆，楚文娟，骆震，胡建东，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：