菜豆荚长基因紧密连锁的分子标记的引物及其选育方法技术

本发明专利技术涉及一种菜豆荚长基因紧密连锁的分子标记Pv_0026128及其KASP引物序列，该标记位于1号染色体上19213953bp的位置，可利用该标记扩增需要鉴定的材料，根据其基因型判断样本是否携带控制荚长的等位变异。利用本发明专利技术提供的分子标记及其引物可以实现对菜豆荚长性状的辅助筛选，在短时间内进行高通量检测，与传统基于表型选择相比，选择结果更准确，便于快速筛选出具有豆荚荚长的菜豆品种或品系，提高菜豆产量。结合KASP的选育方法也大大提高育种效率，从而加快菜豆育种进程。从而加快菜豆育种进程。从而加快菜豆育种进程。

【技术实现步骤摘要】
菜豆荚长基因紧密连锁的分子标记的引物及其选育方法


[0001]本专利技术属于生物分子
，涉及菜豆荚长基因紧密连锁的分子标记的引物及其选育方法。

技术介绍

[0002]菜豆(Phaseolus vulgaris L.)(2n＝2x＝22)隶属豆科(Fabaceae)菜豆族(Trib.Phasoleae DC.)菜豆属(Phaseolus L.)，是世界范围内最重要的豆类作物。菜豆为自花授粉二倍体，基因组大小约600Mb。野生菜豆起源于美洲，经长期驯化和地理隔离后，形成了安第斯和中美洲两个多样性中心，栽培菜豆主要包括两种类型，即以干籽粒做粮食或饲料的粮用型菜豆(dry bean)，和以嫩荚做蔬菜使用的菜用型菜豆(snap bean)。菜豆约在15世纪传入我国，别名四季豆、刀豆、春分豆、梅豆、芸豆，玉豆等，既是我国重要的食用豆类，也是我国广泛栽培的重要豆类蔬菜。据联合国粮农组织2020年统计，我国粮用型菜豆的种植面积约为74.21万公顷，产量约占全球粮用型菜豆总产量的五分之一，菜用型菜豆的种植面积约为66.61万公顷(https://www.fao.org/faostat/zh/#data/QI)。
[0003]菜豆主要以嫩荚为食用器官，荚长既是菜豆重要的农艺性状，也是生产上重要的产量性状，因此，选育长荚品种一直是菜豆育种的重要目标。菜豆荚长为典型的数量性状，受多基因控制且受环境影响很大。传统育种中根据荚长表型进行长荚性状的选择，选育结果准确性受环境影响较大，且耗时费力，而基于基因型选择的分子标记辅助选择技术则能有效提高选择的效率，大大减轻田间工作量，缩短育种进程。
[0004]随着菜豆基因组的释放和基因组测序技术的快速发展，单核苷酸多态性标记(single nucleotide polymorphism，SNP)由于其数量多、多态性丰富逐步成为菜豆遗传研究的主流标记。如Song et al.(2015)通过对17份菜豆种质测序后鉴定出992,682个SNP，据此开发了含5398个SNP的高质量芯片BARCBean6K_3BeadChip；Wu et al.(2020)通过对683份菜豆种质重测序，鉴定出4,811,097个高质量SNP，尽管这些海量SNP信息为菜豆遗传和育种研究提供了强有力的工具，但在使用SNP标记进行基因型鉴定时，由于芯片造价较高、锚定的SNP无法灵活替换，而重测序技术不仅费用高，在不同材料间对SNP鉴定的重复性也较差，因而在普通育种单位中应用受限。竞争性等位变异特异性PCR(Kompetitive Allele Specific PCR，KASP)技术由于在SNP数目和群体大小上可灵活选择的优势，逐步成为利用SNP标记开展个性化研究的理想方法。如Hurtado
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Gonzales et al.(2017)将BARCBean6K_3BeadChip芯片上的SNP转化为KASP标记用于菜豆荚长基因的精细定位。此外，KASP标记在豇豆、瓠瓜等作物上也已经广泛用于遗传多样性分析。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供与菜豆荚长基因紧密连锁的分子标记及其引物，并提供利用该标记进行对荚长辅助育种的方法。该方法首先利用全基因组关联分析的方法，获得与荚长基因紧密连锁的SNP，再将SNP转化为KASP标记进行验证，并利用该标记扩
增需要鉴定的材料，根据其基因型判断样本荚长的有利等位变异，从而为菜豆荚长性状的遗传改良提供新的技术支撑。
[0006]为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0007]1、本专利技术首先构建了一个含88份普通菜豆种质群体，其中包括62个地方品种和26个栽培品种。再对此群体进行表型和基因型鉴定：参照《菜豆种质资源描述规范和数据标准》，每份材料随机选取10株进行嫩荚长的农艺性状调查，调查荚长性状时每份材料至少取10个处于商品成熟期的鲜荚，利用尺子精确测量嫩荚长，取平均值作为鉴定结果，最终得到嫩荚长的表型数据。为确定群体的基因型，再对88份材料进行了Illumina重测序，并筛选出高质量的SNP进行群体结构分析。再利用Tassel 5.0进行荚长GWAS分析，取LOD值≥3.5的SNP定义为与荚长性状显著相关的SNP。本专利技术发现1号染色体上19213953bp的位置处标记Pv_0026128与荚长显著相关，说明该标记与控制荚长的基因紧密连锁，利用该标记扩增需要鉴定的材料，根据其基因型即可判断样本是否携带控制嫩荚长的有利等位变异。
[0008]2、针对该SNP位点Pv_0026128设计KASP特异性引物和通用引物，一种扩增与菜豆荚长基因紧密连锁的标记的KASP引物，所述引物序列如下：
[0009]Pv_0026128KASP引物：
[0010]Pv_0026128Primer1：
[0011]5’‑
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAGTTGCTTCAACCTGGAGC
‑3’
；
[0012]Pv_0026128Primer2：
[0013]5’‑
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAGTTGCTTCAACCTGGAGT
‑3’
；
[0014]Pv_0026128Primer1和Pv_0026128Primer2为2条特异性引物，分别连接不同的荧光序列；
[0015]Pv_0026128Primer_Common：
[0016]5’‑
TAAGTAATTGTTATCGCTTGCTGACCT
‑3’
。
[0017]进一步，其中Pv_0026128Primer1连接FAM基团，Pv_0026128Primer2连接HEX基团。
[0018]3、以上技术方案中所述KASP引物、含有KASP引物的试剂或试剂盒在检测菜豆荚长基因中的应用。
[0019]4、利用菜豆荚长基因紧密连锁的分子标记的KASP引物进行选育不同荚长菜豆品种的方法，所述方法具体包括以下步骤：
[0020]S1、提取菜豆植株样本基因组DNA；
[0021]S2、以菜豆植株样本基因组DNA为模板，利用Pv_0026128的KASP引物进行KASP反应检测；
[0022]S3、读取KASP反应检测的荧光信号，若菜豆样本基因组DNA显示FAM信号，则即可判断该样本携带长荚性状基因型；若菜豆样本基因组DNA显示HEX信号，则即可判断该样本携带短荚性状基因型。
[0023]进一步，选育不同荚长菜豆品种的方法中，其中Primer1连接FAM基团，Primer2连接HEX基团。
[0024]进一步，选育不同荚长菜豆品种的方法中，KASP反应检测还包括2X KASP Master mix试剂。
[0025]进一步，选育不同荚长菜豆品种的方法中，KASP反应检测的PCR体系为：DNA 0.8μ
l，2x KASP Master mix 0.8μl。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测菜豆荚长基因紧密连锁的分子标记的KASP引物，其特征在于，所述分子标记为Pv_0026128，位于菜豆基因组Phaseolus vulgaris v2.1 1号染色体19213953bp处，多态性为C/T，检测所述分子标记的KASP引物为以下具体序列：Pv_0026128KASP引物：Pv_0026128Primer1：5
’‑
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAGTTGCTTCAACCTGGAGC
‑3’
；Pv_0026128Primer2：5
’‑
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAGTTGCTTCAACCTGGAGT
‑3’
；Pv_0026128Primer1和Pv_0026128Primer2为2条特异性引物，分别连接不同的荧光序列；Pv_0026128Primer_Common：5
’‑
TAAGTAATTGTTATCGCTTGCTGACCT
‑3’
。2.权利要求1所述KASP引物，其特征在于，其中Pv_0026128Primer1连接FAM基团，Pv_0026128Primer2连接HEX基团。3.权利要求1或2所述KASP引物、含有KASP引物的试剂或试剂盒在检测菜豆荚长基因中的应用。4.利用权利要求1所述检测菜豆荚长基因紧密连锁的分子标记的KASP引物进行选育不同菜豆荚长品种的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：S1、提取菜豆植株样本基因组DNA；S2、以菜豆植株样本基因组DNA为模板，利用Pv_0026128KASP引物进行KASP反应检测；所述Pv_0026128KASP引物为：Pv_0026128Primer1：5
’‑
GAAG...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴新义，李貌，吴苏淇，汪宝根，李国景，吴晓花，鲁忠富，汪颖，王尖，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：