一种稳定过表达SRSF3的RAW264.7细胞系、其制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种稳定过表达SRSF3的RAW 264.7细胞系、其制备方法及其应用，属于生物医学技术领域。本发明专利技术构建过表达SRSF3的Lenti

【技术实现步骤摘要】
一种稳定过表达SRSF3的RAW 264.7细胞系、其制备方法及应用


[0001]本专利技术涉及生物医学
，特别是涉及一种稳定过表达SRSF3的RAW264.7细胞系、其制备方法及应用。

技术介绍

[0002]SRSF3基因富含丝氨酸/精氨酸剪接因子3(serine/arginine
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rich splicing factor3，SRSF3)，是一种富含丝氨酸/精氨酸(S/R)重复序列的蛋白质，它们具有相似的结构域，即位于氨基末端(N末端)的RNA识别结构域(RNA recognition motif，RRM结构域)和位于羧基末端(C末端)含有高度磷酸化的丝氨酸和精氨酸重复序列的结构域(arginine/serine
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rich domain，RS结构域)。在RNA剪接体的组装和选择性剪接的调控过程中具有重要的作用。通过选择性剪接影响细胞生物学的各个方面，包括增殖、分化、细胞周期、代谢、凋亡、迁移、侵袭和血管生成等。
[0003]人们希望能在哺乳动物细胞中表达目的基因，目前采用的有三大类病毒表达载体：腺病毒表达载体、逆转录病毒表达载体和慢病毒表达载体，其中逆转录病毒载体只能感染分裂期细胞，而且容量有限，腺病毒一般不能整合到染色体上，只能进行瞬时感染。慢病毒载体(Lentiviral vector)是以HIV
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1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体，区别于一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有干扰能力。慢病毒还具有可以容纳外源性基因片段大，并且可以长期表达等显著优点。
[0004]RAW 264.7细胞是源自BALB/c小鼠Abelson鼠科白血病病毒诱导的小鼠单核巨噬细胞。细胞体积小，用脂质体瞬转SRSF3转染效果差，转移到细胞内的DNA半衰期短，转染时细胞往往会受到损害。RAW 264.7细胞本身具有很强的贴壁性和伪足产生性，以往研究表明它被siRNA转染的效率低下，目前关于慢病毒载体转染RAW 264.7细胞的相关报道较少，如何高效、可靠地转染RAW264.7细胞仍需进一步研究。
[0005]另外，不同的转染基因，对于巨噬细胞的转染效果不同，同时对巨噬细胞的功能也会产生不同的影响。

技术实现思路

[0006]针对现有技术中存在的SRSF3转染效果差、转移到细胞内的DNA半衰期短，转染时细胞受到损害的问题，本专利技术提供了一种稳定过表达SRSF3的RAW 264.7细胞系及应用，具有较高的转染效率。
[0007]作为本专利技术的第一个方面，在于提供一种稳定过表达SRSF3的RAW 264.7细胞系，通过慢病毒载体转染方法获得，SRSF3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]所述稳定过表达SRSF3的RAW 264.7细胞系具有抑制炎症的作用。
[0009]作为本专利技术的第二个方面，在于提供这种稳定过表达SRSF3的RAW 264.7细胞系的制备方法，包括如下步骤：
[0010]步骤一、构建过表达SRSF3的Lenti
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Flag
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hyg
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SRSF3质粒；
[0011]步骤二、将步骤一构建的Lenti
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Flag
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hyg
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SRSF3质粒与psPAX2和pMD2.G包装载体构成三质粒表达系统，共转染293T细胞，收集慢病毒并浓缩；
[0012]步骤三、以慢病毒转染RAW 264.7巨噬细胞，获得过表达SRSF3基因的稳转细胞株。
[0013]优选的，步骤一中，以序列表SEQ ID NO.4所示的Lenti
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Flag
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hyg载体和SRSF3基因制得Lenti
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Flag
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hyg
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SRSF3目的质粒。对SRSF3基因进行PCR扩增、电泳、回收后，将回收的SRSF3基因条带与Lenti
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Flag
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hyg载体进行双酶切，再次电泳和回收，而后采用连接酶连接。
[0014]优选的，步骤一中，以序列表SEQ ID NO.2～3所示的引物对SRSF3基因进行扩增，得到PCR扩增产物。
[0015]优选的，步骤一中，将所得PCR扩增产物与loading buffer混合后加入到琼脂糖凝胶胶孔中，缓冲体系为1
×
TAE缓冲液，120V恒压下电泳30min；在紫外照射下切胶回收；采用普通琼脂糖凝胶回收DNA；并将载体与目的片段同时双酶切，再次电泳和利用琼脂糖凝胶回收，分别得到SRSF3和Lenti
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Flag
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hyg载体的回收产物；最后用T4DNA连接酶将目的片段连接到载体质粒上。
[0016]进一步的，步骤一中，采用T4DNA连接酶连接的条件为：取获得的回收产物Lenti
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Flag
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hyg载体、SRSF3加入EP管中，再加入1μL T4 DNA Ligase、2μL10
×
buffer，ddH2O补足20μL。4℃冰箱过夜。
[0017]进一步的，步骤一中，SRSF3与Lenti
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Flag
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hyg载体的质量比为10:3～10:10，优选10:3。
[0018]优选的，步骤一中，还包括将SRSF3基因和Lenti
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Flag
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hyg载体的连接产物转化入感受态细胞DH5α中进行表达，而后提取Lenti
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Flag
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hyg
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SRSF3目的质粒。
[0019]进一步的，步骤一中，PCR反应体系为：
[0020]试剂20μL反应体系2
×
Pfu MasterMix(Dye)10Forward Primer1Reverse Primer1Template DNA0.5ddH2Oup to 20
[0021]PCR反应条件为：
[0022]步骤温度时间预变性94℃2min变性94℃30s退火50
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62℃30s延伸72℃60s终延伸72℃5min
[0023]变性、退火、延伸进行30个循环。
[0024]优选的，步骤二中，Lenti
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Flag
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hyg
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SRSF3目的质粒、psPAX2、pMD2.G质量比为(2～6):4:2。
[0025]更优选的，步骤二中，Lenti
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Flag
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hyg
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SRSF3目的质粒、psPAX2、pMD2.G质量比为4:4:2。
[0026]优选的，步骤三中将慢病毒感染RAW 264.7细胞后，加潮霉素B进行筛选，得到稳定本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种稳定过表达SRSF3的RAW 264.7细胞系，其特征在于，具有慢病毒载体，SRSF3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的一种稳定过表达SRSF3的RAW 264.7细胞系的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一、构建过表达SRSF3的Lenti
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Flag
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hyg
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SRSF3质粒；步骤二、将步骤一构建的Lenti
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Flag
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hyg
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SRSF3质粒与psPAX2和pMD2.G包装载体构成三质粒表达系统，共转染293T细胞，收集慢病毒并浓缩；步骤三、以步骤二收集并浓缩的慢病毒转染RAW 264.7巨噬细胞，获得过表达SRSF3基因的稳转细胞株。3.根据权利要求2所述的一种稳定过表达SRSF3的RAW 264.7细胞系的制备方法，其特征在于，步骤一中，以序列表SEQ ID NO.4所示的Lenti
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Flag
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hyg载体和SRSF3基因制得Lenti
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Flag
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hyg
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SRSF3目的质粒。4.根据权利要求3所述的一种稳定过表达SRSF3的RAW 264.7细胞系的制备方法，其特征在于，步骤一中，对SRSF3基因进行PCR扩增、电泳、回收后，将回收的SRSF3基因条带与Lenti
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Flag
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hyg载体进行双酶切，再次电泳和回收，而后采用连接...

【专利技术属性】
技术研发人员：李雅林，毛双双，刘凯，李明亮，何浩，刘有旺，康莉，封勇，王琪，
申请(专利权)人：山东第一医科大学山东省医学科学院，
类型：发明
国别省市：