一种基于CRISPR的呼吸道病毒检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于CRISPR的呼吸道病毒检测方法，涉及病毒检测技术领域。S1：样本处理体系的建立和优化；S2：基于cas12a的核酸检测体系建立；S3：建立基于cas12a的流感病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道合包病毒等检测方法；S4：阳性样本验证；S5：核酸提取；S6：病毒检测；S7：临床样本验证；对步骤S6中经PCR检测和cas12的病毒检测后的阳性样本进行临床样本验证；S8：严寒条件场地检测；将临床样本验证后的样本在严寒条件下进行检测。SHERLOCR利用RNA杂交和基因编辑技术建立的情准核酸检测技术，该技术使用未经纯化的样品核酸进行PCR扩增，减少了核酸提取过程的核酸损失，在提高精确度的同时保证了灵敏度，通过使用多个crRNA探针，可提高SHERLOCK检测的灵敏度。SHERLOCK检测的灵敏度。SHERLOCK检测的灵敏度。

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPR的呼吸道病毒检测方法


[0001]本专利技术涉及病毒检测
，更具体地说，它涉及一种基于CRISPR的呼吸道病毒检测方法。

技术介绍

[0002]呼吸道病毒是引起重大公共卫生事件的重要病毒，常见的致病病毒包括流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、新型冠状病毒等，病毒在寒冷环境下具有更长的生命周期，有研究表明，病毒在
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20℃的环境下可存活20年以上。我国在北部和西部都有大量寒带地区，且具有潜在的冲突可能性。建立现场即使快速检测技术能提升应对包含呼吸道病毒在内的寒区生物安全事件的处置能力。呼吸道病毒具有发病率高、传播快、极易引起严重的公共安全事件，我们需要更加快速、精准的检测方法来实现早发现、早隔离、早治疗的目标。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是提供一种基于CRISPR的呼吸道病毒检测方法，通过CRISPR系统SHERLOCK技术，使用多个crRNA探针，提高SHERLOCK技术检测的灵敏度，从而无需进行反转录PCR，直接测定病毒的RNA。基于CRISPR系统的检测信号输出，既可以用可视化检测，也可以用荧光信号检测，实现POCT或战现场病毒的快速检测。本专利技术针对寒区重要呼吸道病毒现场即时检测这一技术问题，重点解决寒区重要呼吸道病毒现场即时检测的短板问题，实现呼吸道病原快速检测。
[0004]本专利技术的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种基于CRISPR的呼吸道病毒检测方法，包括如下流程步骤：
[0005]S1：样本处理体系的建立和优化；
[0006]S2：基于cas12a的核酸检测体系建立；
[0007]S3：建立基于cas12a的流感病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道合包病毒等检测方法；
[0008]S4：阳性样本验证；
[0009]S5：核酸提取；将经步骤S4验证的阳性样本分为两组，分别采用对照方法和实验方法进行核酸提取；
[0010]S6：病毒检测；将步骤S5中采用对照方法进行核酸提取的阳性样本进行PCR检测；将步骤S5中采用实验方法进行核酸提取的阳性样本进行基于cas12的病毒检测方法；
[0011]S7：临床样本验证；对步骤S6中经PCR检测和cas12的病毒检测后的阳性样本进行临床样本验证；
[0012]S8：严寒条件场地检测；将临床样本验证后的样本在严寒条件下进行检测。
[0013]综上所述，本专利技术具有以下有益效果：SHERLOCR利用RNA杂交和基因编辑技术建立的情准核酸检测技术，该技术可使用未经纯化的样品核酸进行PCR扩增，减少了核酸提取过程的核酸损失，在提高精确度的同时保证了灵敏度，通过使用多个crRNA探针，可提高SHERLOCK检测的灵敏度，从而无需进行PCR，直接测定病毒DNA或RNA。能在在寒区尤其是因
呼吸道病毒引起的公共安全事件应急反应及防御能力中进行应用。
附图说明
[0014]图1是本专利技术实施例步骤流程图。
具体实施方式
[0015]以下结合附图1对本专利技术作进一步详细说明。
[0016]实施例：一种基于CRISPR的呼吸道病毒检测方法，如图1所示，包括如下流程步骤：
[0017]S1：样本处理体系的建立和优化；SHERLOCK是一种由RNA杂交和基因编辑技术建立的精准核酸检测技术；该技术科使用未经纯化的样品核酸进行PCR扩增，减少了核酸提取过程的核酸损伤，在提高精确度的同时保证了灵敏度；通过使用多个crRNA探针，可提高SHERLOCK检测的灵敏度，从而无需进行PCR，直接测定病毒DNA或RNA。
[0018]S2：基于cas12a的核酸检测体系建立；构建Cas12a蛋白的表达载体，优化蛋白表达条件，表达纯化Cas12a，获得高纯度Cas12a蛋白；构建sgRNA体外转录载体，建立并优化sgRNA的转录体系，重构Cas12a与sgRNA的复合物并检测其核酸酶活性。
[0019]S3：建立基于cas12a的流感病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道合包病毒等检测方法；筛选流感病毒和呼吸道合胞病毒特异性候选检测位点；构建流感病毒和呼吸道合胞病毒的检测方法，通过优化Cas12a与sgRNA的浓度，以及反应缓冲液组成，分别测试可视化和荧光信号的检测，比较两种给信号方式的灵敏度，确定给基于Cas12a的流感病毒和呼吸道合胞病毒的检测方法。
[0020]S4：阳性样本验证；
[0021]S5：核酸提取；将经步骤S4验证的阳性样本分为两组，分别采用对照方法和实验方法进行核酸提取；从标本中提取病毒RNA，使用酶逆转录酶将病毒RNA逆转录为单链cDNA；PCR产物的扩增与标记PCR产物的荧光检测耦合。
[0022]S6：病毒检测；将步骤S5中采用对照方法进行核酸提取的阳性样本进行PCR检测；将步骤S5中采用实验方法进行核酸提取的阳性样本进行基于cas12的病毒检测方法；人为构建一个特异性识别细胞基因组的间隔重复序列，然后让其与cas9蛋白结合形成复合物，去切割靶向基因组，利用细胞基因组自身的DNA修复能力进行同源重组修复，获得相应的精确基因编辑的细胞，当间隔重复序列和cas12日蛋白形成复合物后，将体系中加入间隔重复序列的识别序列，核蛋白复合体即获得非特异性RNA酶的活性，可以无差别的降解体系中的RNA。该方法是一种全新的等温扩增技术，特异性强，确定而且能结合各种给信号方式，实现不同的信号输出，可以是荧光信号，也可以是可视化检测。
[0023]S7：临床样本验证；对步骤S6中经PCR检测和cas12的病毒检测后的阳性样本进行临床样本验证；
[0024]S8：严寒条件场地检测；将临床样本验证后的样本在严寒条件下进行检测。
[0025]本具体实施例仅仅是对本专利技术的解释，其并不是对本专利技术的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本专利技术的权利要求范围内都受到专利法的保护。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR的呼吸道病毒检测方法，其特征是：包括如下流程步骤：S1：样本处理体系的建立和优化；S2：基于cas12a的核酸检测体系建立；S3：建立基于cas12a的流感病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道合包病毒等检测方法；S4：阳性样本验证；S5：核酸提取；将经步骤S4验证的阳性样本分为两组，分别采用对照方法和实验方法进行核酸提取...

【专利技术属性】
技术研发人员：任微，褚美玲，赵汐渟，
申请(专利权)人：中国人民解放军北部战区总医院，
类型：发明
国别省市：