一种用于清除细胞培养中黑胶虫污染的试剂及方法技术

本发明专利技术提供一种用于清除细胞培养中黑胶虫污染的试剂及方法。具体为使用重量百分比终浓度为0.01％～0.05％黄腐酸处理细胞1h

【技术实现步骤摘要】
一种用于清除细胞培养中黑胶虫污染的试剂及方法


[0001]本专利技术涉及一种用于清除细胞培养中黑胶虫污染的试剂及方法。

技术介绍

[0002]黑胶虫也称钙化纳米颗粒细菌，一般存在血清里，细胞培养时0.22um的滤膜过滤并不能有效地清除血清中的黑胶虫。黑胶虫污染是细胞培养过程中常见的污染之一，其有时会在400倍显微镜下呈小黑点在动，小黑点有时呈点状或片状，运动形式为在原地振动，类似布朗运动，常称之为黑胶虫。黑胶虫表面具有独特的以羟基磷灰石为主要成分的矿化生物被膜结构，使黑胶虫能够耐受像射线照射、高温等不利的物理条件，对多种抗生素具有耐药性。
[0003]目前市面上清除细胞培养中黑胶虫污染多采用多种高浓度抗生素联合用药，但由于黑胶虫耐药性高，常常不能完全清除这种耐药菌，并且高浓度抗生素对培养的细胞代谢影响比较大，甚至导致细胞死亡。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种用于清除细胞培养中黑胶虫污染的试剂及其使用方法，能有效地清除黑胶虫，不影响细胞本身的代谢。
[0005]为实现上述目的，技术方案如下：
[0006]第一方面，提供一种细胞培养中黑胶虫污染清除试剂组合物，其包含以下组分：
[0007]黄腐酸，使用重量百分比终浓度为0.01％～0.05％，
[0008]钙离子螯合剂,使用重量百分比终浓度为0.02％～0.05％，
[0009]四环素类抗生素，使用重量百分比终浓度为0.005％～0.01％。
[0010]所述钙离子螯合剂选用BAPTA或EDTA；
[0011]所述四环素类抗生素选用盐酸四环素或盐酸强力霉素。
[0012]进一步地，所述BAPTA使用时溶解于pH11 1mol/L NaOH；EDTA使用时溶解于pH8 1mol/L NaOH；盐酸四环素和盐酸强力霉素使用时溶解于二甲基亚砜。
[0013]本专利技术还提供了上述的一种用于清除细胞培养中黑胶虫污染试剂组合物使用方法，包括以下步骤：
[0014](1)复苏培养黑胶虫污染的细胞，显微镜下观察确认细胞呈黑胶虫污染；
[0015](2)当细胞密度达到50％
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60％时，加入重量百分比终浓度为0.01％～0.05％黄腐酸处理细胞1h
‑
3h；
[0016](3)换液，加入重量百分比终浓度为0.02％～0.05％钙离子螯合剂处理细胞30min
‑
60min；
[0017](4)换液，加入重量百分比终浓度为0.005％～0.01％四环素类抗生素处理细胞2天
‑
4天。
[0018]本专利技术的工作原理：
[0019]由于黑胶虫表面具有独特的以羟基磷灰石为主要成分的矿化生物被膜结构，钙化的生物被膜结构使得抗生素很难进入黑胶虫体内，使其对多种抗生素具有耐药性。黄腐酸是黑胶虫钙化生物被膜可渗透的胶体聚电解质，它能破坏黑胶虫钙化的生物被膜结构。BAPTA和EDTA都是钙离子螯合剂，它们能进一步削弱黑胶虫的钙化生物被膜结构。盐酸四环素和盐酸强力霉素为四环素类广谱抗生素，它们是金属蛋白酶的广谱抑制剂，也具有螯合钙离子的功能，通过特异性地与细菌核糖体30S亚基的A位置结合，抑制肽链的增长和影响细菌蛋白质的合成而引起细菌死亡。
[0020]本专利技术所达到的有益效果是：
[0021]本申请的黑胶虫清除试剂组合物，适用于去除体外培养的细胞黑胶虫，巧妙的靶向联合用药增强了黑胶虫对抗生素的敏感性，作用周期仅需要一周便可全部杀死黑胶虫，降低了细胞的抗药性和药物对细胞的毒性，不影响细胞本身的代谢，并且经过处理的细胞表面光滑，布朗运动的黑色颗粒消失。
附图说明
[0022]附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：
[0023]图1是处理前IM
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9细胞白光视野；
[0024]图2是理后IM
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9细胞白光视野；
[0025]图3是处理前原代小鼠肝星状细胞白光视野；
[0026]图4是处理后原代小鼠肝星状细胞白光视野；
[0027]图5是处理前CHL细胞白光视野；
[0028]图6是处理后CHL细胞白光视野；
[0029]图7是对比方1清除细胞黑胶虫污染效果图；
[0030]图8是对比方2清除细胞黑胶虫污染效果图；
[0031]图9是对比方3清除细胞黑胶虫污染效果图；
[0032]图10是对比方4清除细胞黑胶虫污染效果图；
[0033]图11是对比方5清除细胞黑胶虫污染效果图。
具体实施方式
[0034]以下结合附图对本专利技术的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0035]实施例1
[0036]黑胶虫清除试剂组合配置：
[0037](1)取8g NaCl,0.2g KCl,0.2g KH2PO4,1.38g Na2HPO4溶于1000mL去离子水，经过121℃高温、103Kpa高压灭菌，制成0.01M PBS溶液，4℃储存备用。
[0038](2)4g NaOH溶于100mL去离子水，调节pH11制成pH11 1mol/L NaOH溶液，4℃储存备用。
[0039](3)取5g黄腐酸溶于10mL 0.01M PBS溶液中，经过121℃高温、103Kpa高压灭菌，制成50％黄腐酸溶液，分装，
‑
20℃冻存备用。
[0040](4)取5g BAPTA溶于10mL pH11 1mol/L NaOH溶液中，经过0.22um一次性滤器过滤除菌，制成50％BAPTA溶液，分装，
‑
20℃冻存备用。
[0041](5)取1g盐酸强力霉素溶于10mL二甲基亚砜中，经过0.22um一次性滤器过滤除菌，制成10％盐酸强力霉素溶液，分装，
‑
20℃冻存备用。
[0042]清除黑胶虫污染的方法，具体步骤如下：
[0043]S1、复苏黑胶虫已污染的细胞，调整细胞密度进行铺板，37℃，5％CO2培养箱进行培养；
[0044]S2、当细胞密度达到60％时，将浓度50％黄腐酸加入细胞的含10％FBS无青霉素
‑
链霉素双抗培养基中稀释1000倍，稀释后黄腐酸重量百分比终浓度为0.05％，37℃，5％CO2培养箱条件下处理细胞1h；
[0045]S3、离心后换液，将浓度50％BAPTA加入细胞的含10％FBS无青霉素
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链霉素双抗培养基中稀释2000倍，稀释后BAPTA重量百分比终浓度为0.025％，37℃，5％CO2培养箱条件下处理细胞30min；
[0046]S4、离心后换液，将浓度10％盐酸强力霉素加入细胞的含10％FBS无青霉素
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链霉素本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于清除细胞培养中黑胶虫污染的试剂，其特征在于，包括以下组分：黄腐酸，重量百分比终浓度为0.01％～0.05％，钙离子螯合剂,重量百分比终浓度为0.02％～0.05％，四环素类抗生素，使用重量百分比终浓度为0.005％～0.01％。2.如权利要求1所述的用于清除细胞培养中黑胶虫污染的试剂，其特征在于，所述钙离子螯合剂为BAPAT或EDTA。3.如权利要求1所述的用于清除细胞培养中黑胶虫污染的试剂，其特征在于，所述四环素类抗生素选用盐酸四环素或盐酸强力霉素。4.如权利要求2所述的用于清除细胞培养中黑胶虫污染的试剂，其特征在于，BAPTA使用时溶解于pH11 1mol/L NaOH；EDTA使用时溶解于pH8 1mol/LNaOH。5.如权利要求3所述的用于清除细胞培养中黑胶虫污染的试剂，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘艳丽，
申请(专利权)人：无锡欣润生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：