一种7α-羟基类固醇脱氢酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术属于7α

【技术实现步骤摘要】
一种7
α
‑
羟基类固醇脱氢酶突变体及其应用


[0001]本专利技术属于7α
‑
羟基类固醇脱氢酶应用
，具体涉及一种7α
‑
羟基类固醇脱氢酶突变体及其应用。

技术介绍

[0002]牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)是熊胆汁的主要有效成分，也是中药人工合成熊胆粉的主要成分，是广泛存在于人和多种动物胆汁中的一种结合型胆汁酸，有着多种生理药理作用。
[0003]TUDCA自1902年从熊胆中发现，研究表明其具有解痉、抗惊厥、抗炎及溶胆石等作用。临床主要用于治疗胆囊胆固醇结石、原发硬化性胆管炎、原发胆汁性肝硬化和慢性丙型病毒性肝炎等，1991年首次在意大利上市熊去氧胆酸胶囊(由意大利贝思迪大药厂研制)，2007年以商品名滔罗特(taurolite)获准在中国销售。牛磺熊去氧胆酸分子侧链上比熊去氧胆酸多了极性基团牛磺酸基，是人体中天然存在的结合型胆汁酸，具有重要的生理活性，相比熊去氧胆酸UDCA，TUDCA其亲水性更强，水溶性更好，生物利用度更强，毒性更低，其抑制胆固醇合成(溶解胆固醇结石)效果更好，引起溶血的可能性低，拮抗疏水胆碱对胆囊收缩的抑制作用更强，对胃黏膜损伤、疏水毒性最小。此外还有研究表明TUDCA因为可减少细胞凋亡，减弱氧化应激和减少内质网应激等能力，对视网膜退行性疾病(年龄相关黄斑变性、糖尿病引起的视网膜问题等)、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、脑缺血等均有一定疗效。引起了广泛关注，因此开发具有独立自主知识产权的TUDCA的合成路线，对于提升我国医药总体质量水平具有重要的意义，也具有很好的市场前景。
[0004]现有公布的牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)和TUDCA的制备方法主要是用鸡胆作为原材料，通过醇提取和层析去杂获得有效成份TCDCA和牛磺胆酸，其中TCDCA再经过两步酶法(7α
‑
羟基类固醇脱氢酶与7β
‑
羟基类固醇脱氢酶)转化为牛磺熊去氧胆酸，经精制获得TUDCA结晶粉(附图1)；或者以熊去氧胆酸为原料，经过化学混合酸酐法形成牛磺熊去氧胆酸粗品，经丙酮和水重结晶得到高纯度的牛磺熊去氧胆酸。
[0005]在前期的研究工作中，我们对来源于产气柯林斯菌的7β羟基类固醇脱氢酶进行了改造与筛选(专利号：201811135213.X)，获得的突变体Ca7β
‑
2，其催化还原活力相比野生型的酶提高了7.6倍，还原氧化活力比值提高了4倍，在浓度为100mM的UDCA条件下孵育1小时，活力仅下降了8.4％；在30℃，pH 8.0条件下催化合成UDCA和T
‑
UDCA，转化时间由24小时缩短到2小时，其中底物7
‑
KLCA的摩尔转化率为100％，底物T
‑7‑
KLCA摩尔转化率为99.5％。突变后的7β
‑
HSDH极大程度地降低了生产成本，可以进行TUDCA的工业规模化生产应用。
[0006]为了进一步推进并实现产业化，我们对来源于梭菌属Clostridium absonum的7α
‑
羟基类固醇脱氢酶也进行了定向改造和筛选(Huang,Zhao,Zhou,&Xu,2019，Enhanced activity and substrate tolerance of 7α
‑
hydroxysteroiddehydrogenase by directed evolution for 7
‑
ketolithocholicacid production)，结果表明：所获得的突变体7α
‑
3与野生型酶相比，其比活性提高了5.5倍，对鹅去氧胆酸(CDCA)和NADP
+
的催化效
率分别提高了10倍和14倍。此外，与野生型相比，突变体7α
‑
3在高浓度底物存在下也显示出显著增强的耐受性。但是，该突变体酶7α
‑
3依然无法进行TUDCA合成的工业化应用，其主要问题在于，虽然突变体酶7α
‑
3相比野生型的比活力和底物耐受性提高了，但是却存在着热稳定性差，无法多批次使用导致成本高(常温放置会导致活力丢失)，且存在着产物T
‑7‑
KLCA反馈抑制的问题，导致转化收率低，反应时间长，无法进行TUDCA的酶法合成工业化应用。
[0007]因此，采用定向进化的技术手段对野生型的来源于梭菌属Clostridium absonum的7α羟基类固醇脱氢酶进行突变改造并筛选，获得满足工业应用属性(热稳定性好、催化活性高、产物抑制率低)的突变体酶极具有产业化的价值和前景。

技术实现思路

[0008]本专利技术的首要目的在于提供一种7α
‑
羟基类固醇脱氢酶突变体，以解决野生型7α
‑
羟基类固醇脱氢酶制备牛磺7
‑
酮石胆酸(T
‑7‑
KLCA)或7
‑
酮石胆酸(7
‑
KLCA)时，野生型7α
‑
羟基类固醇脱氢酶比活力低、热稳定性差，产物反馈抑制严重所导致的收率差问题。
[0009]为了达到上述目的，本专利技术所采用的技术方案如下：
[0010]本专利技术所提供的技术方案之一是：提供一种7α
‑
羟基类固醇脱氢酶突变体。本专利技术利用定向进化的技术手段对来源于梭菌属Clostridium absonum的7α
‑
羟基类固醇脱氢酶(Ca7α
‑
HSDH)进行定向改造，以获得热稳定性更好、转化收率更高、对产物抑制更弱的突变体酶。
[0011]为了实现此目的，在基础的实施方案中，本专利技术提供一种7α
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羟基类固醇脱氢酶突变体，所述的突变体在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的野生型7α
‑
羟基类固醇脱氢酶中突变多个氨基酸位点，突变的氨基酸位点包括：V96T(第96位氨基酸由V突变为T)，D152K(第152位氨基酸由D突变为K)，F204Y(第204位氨基酸由F突变为Y)中的一个或多个。
[0012]在一种优选的实施方案中，本专利技术突变体的突变方式包括以下6种中任一种：V96T；D152K；F204Y；V96T和D152K；V96T和F204Y；V96T和D152K和F204Y；序列依次如SEQ ID NO.2
‑
7所示。
[0013]本专利技术的第二个目的是提供编码前述7α
‑
羟基类固醇脱氢酶突变体的多核苷酸，以能够使编码的7α
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羟基类固醇脱氢酶突变体较野生型7α
‑
羟基类固醇脱氢酶在催化制备7
‑
KLCA或T
‑7‑
KLCA时具有更高的比活力、更好的热稳定性、更弱的产物抑制，更高的摩尔转化率。
[0014]本专利技术的第三个目的是提供所述的7α<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种7α
‑
羟基类固醇脱氢酶突变体，其特征在于，是对SEQ ID NO.1所示的野生型氨基酸序列进行突变，突变的氨基酸位点包括V96T，D152K，F204Y中的一个或多个。2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于：突变方式包括以下6种中任一种：V96T；D152K；F204Y；V96T和D152K；V96T和F204Y；V96T和D152K和F204Y；序列依次如SEQ ID NO.2
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7所示。3.一种编码权利要求1或2所述的7α
‑
羟基类固醇脱氢酶突变体的核苷酸。4.权利要求1或2所述的7α
‑
羟基类固醇脱氢酶突变体的应用，其特征在于，以牛磺鹅去氧胆酸或鹅去氧胆酸为底物，催化合成牛磺7
‑
酮石胆酸或7
‑
酮石胆酸。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的反应体系中，所述的7α
‑
羟基类固醇脱氢酶突变体酶的投量为500
‑...

【专利技术属性】
技术研发人员：周晶辉，赵士敏，赵强，刘洋，郭川志，曾红宇，许岗，
申请(专利权)人：湖南福来格生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：