一种利用抑制铁载体筛选细菌群体感应抑制剂的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用抑制铁载体筛选细菌群体感应抑制剂的方法。属于病原微生物预防与控制领域，具体步骤：首先，制备CAS培养基，再将制备的CAS培养基与病原菌工作液混匀；然后，将CAS培养基与病原菌工作液的混匀液倒入至培养皿中；最后，采用牛津杯法给药，药物周围呈蓝绿色时即为群体感应抑制剂；本发明专利技术具有简便、快速且通用的优点，可快速高效的筛选病原菌的群体感应抑制剂。本发明专利技术筛选出的群体感应抑制剂可以抑制病原菌生物被膜形成，达到抗感染的目的，具有较好的预防和治疗细菌感染的相关疾病的临床应用前景。病的临床应用前景。病的临床应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种利用抑制铁载体筛选细菌群体感应抑制剂的方法


[0001]本专利技术属于病原微生物预防与控制领域，涉及了一种利用抑制铁载体筛选细菌群体感应抑制剂的方法，具体是涉及群体感应抑制剂的筛选方法和应用，可以用于病原菌群体感应抑制剂的筛选，特别适用于生长时无颜色病原菌群体感应抑制剂的筛选。

技术介绍

[0002]细菌群体感应(QS，quorum sensing)是细胞种内、种间、乃至细菌与宿主之间信号交流的一种机制，包括自诱导物的产生、释放和识别响应，随着细菌数量的增多，自诱导物达到一定阈值，会导致生物被膜的形成、毒力因子的生成与释放、生物发光等。群体感应系统在调控细菌生物被膜的形成，毒力因子的产生过程中发挥至关重要的作用。群体感应作为一种靶标，通过对其进行抑制，破坏滋扰细菌菌群内的通信系统。群体感应抑制剂是一类通过影响群体感应系统来干扰生物被膜形成或破坏生物被膜及毒力因子合成等行为的物质，其抑制群体感应系统既可以增强抗菌药物的效果，又不会诱导抗菌药物耐药性的产生。铁离子是地球上绝大多数生物生存必不可少的元素之一，环境中的大部分铁都是以化合物的形式存在，病原微生物在宿主体内面临着严峻的铁摄取问题，为了维持自身生长并完成各种生理功能进化出了一系列能够螯合、摄取铁的系统(铁载体)，而这些铁载体对细菌毒力因子的释放和生物被膜的形成具有重要的调控作用，对菌体的生长和致病性具有重要的作用。
[0003]铁载体与群体感应系统之间存在着广泛的联系，共同调节菌体毒力因子的表达、生物被膜的形成等多种生理过程，影响着细菌感染的进程。群体感应系统对铁相关基因具有广泛的调节作用，群体感应系统的信号分子PQS可以控制着铁载体pyochelin和pyoverdine合成基因的表达。
[0004]抑制病原菌群体感应并不影响病原菌的生长，但是却可以减少生物被膜的生成，削弱毒力因子的分泌，从而使其不产生耐药性，因此寻找群体感应抑制剂(QSI，quorum sensing inhibitor)对解决细菌耐药性非常重要。因此构建一种简便、高灵敏且通用的QSIs筛选模型是迫在眉睫的。含有铁载体的病原菌在铬天青平板(CAS)模型中生长时呈现橙黄色，铁载体受到抑制时呈蓝绿色，通过颜色的变化筛选QSI，通过干扰病原菌的QS系统为解决细菌高毒力和高耐药性提供了一条重要途径。
[0005]常用的QSIs筛选方法有指示菌株法、生物传感器法、计算机辅助设计法和动物模型法。
[0006]指示菌株法是利用紫色杆菌和根癌农杆菌作为主要指示菌，但是该法不能完全确定待测样品，其筛选结果具有假阳性。生物传感器筛选方法是直接利用QS信号分子合成酶基因的启动子与报告基因融合构建筛选载体，其结果的假阳性也很高。而动物模型筛选方法的实验步骤较为繁琐，其成本也比较高。计算机辅助设计筛选方法属于虚拟筛选，其结果需要进一步验证。

技术实现思路

[0007]专利技术目的：本专利技术的目的是提供了一种通用的群体感应抑制剂的筛选方法。即利用铁载体在CAS平板中颜色的变化来实现群体感应抑制剂的筛选。
[0008]技术方案：本专利技术所述的一种利用抑制铁载体筛选细菌群体感应抑制剂的方法，
[0009]首先，制备CAS培养基，再将制备的CAS培养基与病原菌工作液进行混匀；然后，将CAS培养基与病原菌工作液的混匀液倒入至培养皿中；最后，采用牛津杯法给药，药物周围呈蓝绿色时，即为群体感应抑制剂。
[0010]进一步的，其具体操作步骤：
[0011](1)、首先，量取80mL固体培养基、10mL的磷酸盐缓冲液和10mL的CAS染液，将量取好的三者进行混匀后，于121℃高温下进行灭菌15min，从而获得CAS培养基；
[0012](2)、然后，从划线平板中挑取病原菌的单菌落，将其接种到5mL的液体培养基中，置于28
‑
37℃、180rpm的条件下振荡17
‑
48h后得到病原菌种子液，将得到的病原菌种子液按照1:1000的浓度稀释于液体培养基中，从而得病原菌工作液，搁置待用；
[0013](3)、再次，将步骤(1)中得到的进行了灭菌后的CAS培养基冷却至30
‑
40℃时，将其与步骤(2)中得到的病原菌工作液进行混匀，再将混匀好的含病原菌工作液的CAS培养基倒入至培养皿中，此时培养皿呈现蓝绿色；
[0014](4)、最后，待步骤(3)中CAS培养基与病原菌工作液混合的培养皿凝固后，将牛津杯置于培养皿中，再将溶解好的药物加入至牛津杯中，从而得到待培养的培养皿；
[0015]将待培养的培养皿置于28
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37℃的恒温培养箱中过夜培养16
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48h，观察牛津杯周围的颜色变化即可判断该药物是否为病原菌的QSI，此时病原菌生长后的平板颜色显橙黄色，如牛津杯的周围显示为蓝绿色，则为该药物抑制了病原菌的铁载体，即该病原菌的群体感应抑制剂。
[0016]进一步的，在步骤(1)中，所述固体培养基、磷酸盐缓冲液与CAS染液的质量比是8∶1∶1。
[0017]进一步的，所述固体培养基物质包括葡萄糖、蛋白胨、MgSO4·
7H2O、CaCl2及琼脂；其制备方法是：称取100g葡萄糖，20g蛋白胨，0.5g MgSO4·
7H2O，0.5g CaCl2和20g琼脂，将其全部溶于1L的蒸馏水中，混匀备用。
[0018]进一步的，在步骤(1)中，所述磷酸盐缓冲液包括Na2HPO4·
12H2O、NaH2PO4·
2H2O、KH2PO4、NH4Cl及NaCl；
[0019]其制备方法是：称取24.27g的Na2HPO4·
12H2O、5.91g的NaH2PO4·
2H2O、0.75g的KH2PO4、2.50g的NH4Cl及1.25g的NaCl，将其全体溶于1L的蒸馏水中，混匀备用。
[0020]进一步的，在步骤(1)中，所述CAS染液的制备方法是：
[0021]首先，称取0.70g的CAS溶于500mL的蒸馏水中，从而制得CAS溶液；
[0022]其次，其次，称取0.27g的FeCl3溶于含有0.83mL浓盐酸的1L蒸馏水中，从而制得FeCl3溶液，取100mL的FeCl3溶液待用；
[0023]再次，称取1.50g的HDTMA溶于1L的蒸馏水中，从而制得HDTMA溶液，取400mL的HDTMA溶液待用；
[0024]最后，将制得的500mL CAS溶液加入待用的100mL FeCl3溶液中，将其摇匀后再加入待用的400mL的HDTMA溶液中，最后即得CAS染液。
[0025]进一步的，在步骤(4)中，所述溶解好的药物是待筛选的QSIs。
[0026]其中，本专利技术的抑制剂筛选通过如下步骤来实现：(a)、将病原菌在固体培养基上过夜活化，按照2％的比例接种到液体培养基中，于28
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37℃，180rpm培养箱中振荡培养17
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48h；(b)、与1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用抑制铁载体筛选细菌群体感应抑制剂的方法，其特征在于，首先，制备CAS培养基，再将制备的CAS培养基与病原菌工作液进行混匀；然后，将CAS培养基与病原菌工作液的混匀液倒入至培养皿中；最后，采用牛津杯法给药，药物周围呈蓝绿色时，即为群体感应抑制剂。2.根据权利要求1所述的一种利用抑制铁载体筛选细菌群体感应抑制剂的方法，其特征在于，其具体操作步骤：(1)、首先，量取80mL固体培养基、10mL的磷酸盐缓冲液和10mL的CAS染液，将量取好的三者进行混匀后，于121℃高温下进行灭菌15min，从而获得CAS培养基；(2)、然后，从划线平板中挑取病原菌的单菌落，将其接种到5mL的液体培养基中，置于28
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37℃、180rpm的条件下振荡17
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48h后得到病原菌种子液，将得到的病原菌种子液按照1:1000的浓度稀释于液体培养基中，从而得病原菌工作液，搁置待用；(3)、再次，将步骤(1)中得到的进行了灭菌后的CAS培养基冷却至30
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40℃时，将其与步骤(2)中得到的病原菌工作液进行混匀，再将混匀好的含病原菌工作液的CAS培养基倒入至培养皿中，此时培养皿呈现蓝绿色；(4)、最后，待步骤(3)中CAS培养基与病原菌工作液混合的培养皿凝固后，将牛津杯置于培养皿中，再将溶解好的药物加入至牛津杯中，从而得到待培养的培养皿；将待培养的培养皿置于28
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37℃的恒温培养箱中过夜培养16
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48h，观察牛津杯周围的颜色变化即可判断该药物是否为病原菌的QSI，此时病原菌生长后的平板颜色显橙黄色，如牛津杯的周围显示为蓝绿色，则为该药物抑制了病原菌的铁载体，即该病原菌的群体感应抑制剂。3.根据权利要求2所述的一种利用抑制铁载体筛选细菌群体感应抑制剂的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述固体...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾爱群，尹璐军，沈旺，
申请(专利权)人：海南大学，
类型：发明
国别省市：