一种产毒培养基及碳13标记的链格孢霉毒素的制备方法技术

本申请涉及一种产毒培养基及碳13标记的链格孢霉毒素的制备方法。一种产毒培养基，包括如下浓度的组分：C

【技术实现步骤摘要】
一种产毒培养基及碳13标记的链格孢霉毒素的制备方法


[0001]本申请涉及食品安全领域，更具体地说，它涉及一种产毒培养基及碳13标记的链格孢霉毒素的制备方法。

技术介绍

[0002]链格孢霉毒素是由链格孢霉菌产生的次级代谢产物，目前已知的链格孢霉毒素根据其化学结构的不同可以分为5大类，共有70多种。其中，具有明显毒理意义的有细交链格孢霉菌酮酸(tenuazonic acid，TeA)、交链孢酚(alternariol，AOH)、交链孢酚单甲醚(alternariolm onom ethylether，AME)、链格孢霉素(altenuene，ALT)、细格菌毒素I、II、III(altertoxin I、II、III，ATX
‑
I、ATX
‑
II、ATX
‑
III)和腾毒素(Tentoxin，TEN)；其中，细交链孢菌酮酸(TeA)毒素水平位居其首，被美国食品药物管理局列入有毒化学物质登记册中。
[0003]目前检测链格孢霉毒素的检测方法有薄层色谱(TLC)、气相色谱(GC)、液相色谱法(LC)、液质联用(LC
‑
MS)等。在对样品中毒素浓度的精确测定时需要大量标准物质(标准品)，其中同位素内标物质是近年研究的热点。同位素内标物质结合质谱分析，通过对同位素丰度的精确质谱测定和对加入的内标准确称量，可以有效消除基质干扰，不仅如此，同位素内标还可以消除样品前处理过程中的差异，做到对待测物的定量测定。然而国内同位素真菌毒素标准品大多是从国外进口，价格非常昂贵，由此严重限制了相关研究工作的开展。因此研究一种低成本、简单高效的稳定性同位素标记真菌毒素的生产方法，来满足国内研究需求、提高快速检测水平，是亟待解决的问题。

技术实现思路

[0004]为了解决上述技术问题，本申请提供一种产毒培养基及碳13标记的链格孢霉毒素的制备方法。
[0005]第一方面，本申请提供一种产毒培养基，采用如下的技术方案：
[0006]一种产毒培养基，所述产毒培养基包括如下浓度的组分：C
‑
13标记的碳源10
‑
20g/L、硝酸钠0.5
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1.5g/L、氯化铵0.5
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1.5g/L、磷酸氢二钾0.5
‑
1.5g/L、七水硫酸镁0.1
‑
0.8g/L、氯化钾0.1
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0.8g/L以及七水硫酸亚铁5
‑
15mg/L；其余为溶剂水。
[0007]本申请的产毒培养基用于链格孢霉菌的产毒培养，通过采用上述技术方案，采用上述培养基培养链格孢霉菌时，有利于提高链格孢霉菌产生的链格孢霉毒素的浓度，并且可以提高链格孢霉毒素的碳13标记率，有利于提高产品质量的稳定性。此外，本申请的培养基使用无机盐培养基，其成分清晰、杂质少，有利于后续毒素的提取纯化。并且本申请的产毒培养基为液体培养基，可以进一步提高提取效率。
[0008]可选的，所述C
‑
13标记的碳源为13C
‑
葡萄糖、13C
‑
D
‑
甘露糖、13C
‑
乙酸钠、13C
‑
蔗糖、13C
‑
甘油中的一种或多种的组合物。
[0009]优选的，所述C
‑
13标记的碳源为13C
‑
葡萄糖。
[0010]通过采用上述技术方案，采用13C
‑
葡萄糖作为碳源营养物质，葡萄糖作为单糖，更
容易被吸收利用，可以提高产毒量，并且其价格相对便宜，可以降低生产成本。
[0011]可选的，所述产毒培养基包括如下浓度的组分：所述产毒培养基包括如下浓度的组分：13C
‑
葡萄糖10g/L、硝酸钠1g/L、氯化铵1g/L、磷酸氢二钾1g/L、七水硫酸镁0.5g/L、氯化钾0.5g/L以及七水硫酸亚铁10mg/L；其余为溶剂水。
[0012]第二方面，本申请提供一种碳13标记的链格孢霉毒素的制备方法，采用如下的技术方案：
[0013]一种碳13标记的链格孢霉毒素的制备方法，包括如下步骤：
[0014]产孢培养：将活化后的链格孢霉菌的菌丝接种在产孢培养基中，在20
‑
30℃的温度下，培养5
‑
7天后，收集孢子；
[0015]产毒培养：将收集的孢子转入如权利要求1所示的产毒培养基中进行培养，当培养基中的孢子终浓度达到1
×
104‑1×
105个/毫升时，继续在20
‑
30℃的温度下，培养7
‑
10天，得到碳
‑
13标记的链格孢霉毒素。
[0016]多细胞真菌成为霉菌或丝状菌，由孢子和菌丝组成，在接种培养时，一般选择菌丝体接种。在本申请中，在接种产毒培养基进行产孢前培养，后续进行孢子接种，对比菌丝体接种，可以提高C
‑
13的标记率。通过采用上述方案，可以获得毒素浓度含量高且C
‑
13标记率高的链格孢霉毒素，将其作为标准品使用可以降低基质效应，使定量更准确，相较于现有的非标链格孢霉毒素，具有更好的应用前景。并且本申请的制备方法简单、生产周期短，具有较高的工业生产价值。
[0017]可选的，所述产孢培养基包括如下浓度的组分：C
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13标记的碳源3
‑
8g/L、磷酸二氢钾1
‑
2g/L、七水硫酸镁3
‑
8g/L、碳酸钠1
‑
1.5g/L、天门冬酰胺0.5
‑
1.5g/L以及琼脂15
‑
25g/L；其余为溶剂水。
[0018]可选的，所述产孢培养基包括如下浓度的组分：13C
‑
葡萄糖5g/L、磷酸二氢钾1.36g/L、七水硫酸镁5g/L、碳酸钠1.06g/L、天门冬酰胺1g/L以及琼脂20g/L；其余为溶剂水。
[0019]可选的，产毒培养后，采用如下方法提取毒素：将产毒培养后的培养基用酸调节pH为2
‑
3，然后加入二氯甲烷，萃取后，得到含碳13标记的链格孢霉毒素的粗提液。
[0020]可选的，所述制备方法还包括提纯步骤：将含碳13标记的毒素标记物的粗提液采用液相色谱法通过吸附柱分别经过粗纯和精纯处理；
[0021]所述粗纯的流动相A均为0.1vol％甲酸水，流动相B均为甲醇；
[0022]所述粗纯的洗脱方法为：B相含量5％等度洗脱5min，5％
‑
100％梯度洗脱40min，100％等度洗脱10min。
[0023]可选的，所述精纯的流动相A均为0.1vol％甲酸水，流动相B均为甲醇；
[0024]所述精纯的洗脱方法为：B相含量5％等度洗脱5min，5％
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种产毒培养基，其特征在于，所述产毒培养基包括如下浓度的组分：C
‑
13标记的碳源10
‑
20g/L、硝酸钠0.5
‑
1.5g/L、氯化铵0.5
‑
1.5g/L、磷酸氢二钾0.5
‑
1.5g/L、七水硫酸镁0.1
‑
0.8g/L、氯化钾0.1
‑
0.8g/L以及七水硫酸亚铁5
‑
15mg/L；其余为溶剂水。2.根据权利要求1所述的一种产毒培养基，其特征在于，所述C
‑
13标记的碳源为13C
‑
葡萄糖、13C
‑
D
‑
甘露糖、13C
‑
乙酸钠、13C
‑
蔗糖、13C
‑
甘油中的一种或多种的组合物。3.根据权利要求2所述的一种产毒培养基，其特征在于，所述C
‑
13标记的碳源为13C
‑
葡萄糖。4.根据权利要求3所述的一种产毒培养基，其特征在于，所述产毒培养基包括如下浓度的组分：13C
‑
葡萄糖10g/L、硝酸钠1g/L、氯化铵1g/L、磷酸氢二钾1g/L、七水硫酸镁0.5g/L、氯化钾0.5g/L以及七水硫酸亚铁10mg/L；其余为溶剂水。5.一种碳13标记的链格孢霉毒素的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：产孢培养：将活化后的链格孢霉菌的菌丝接种在产孢培养基中，在20
‑
30℃的温度下，培养5
‑
7天后，收集孢子；制备孢子悬液：用无菌水稀释孢子，制成孢子悬液；产毒培养：将孢子悬液经计数后，接种到权利要求1所述的产毒培养基至孢子终浓度为1
×
104‑1×
105个/毫升；然后在20
‑
30℃的温度下，培养7
‑
10...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘红兵，于秋香，刘珂伟，苏东海，李金化，高伟，武永进，崔涛，
申请(专利权)人：青岛普瑞邦生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：