暗纹东方鲀抗菌肽ToNK-lysin及其应用制造技术

本发明专利技术公开了暗纹东方鲀抗菌肽ToNK

【技术实现步骤摘要】
暗纹东方鲀抗菌肽ToNK
‑
lysin及其应用


[0001]本专利技术属于分子生物学
，具体为暗纹东方鲀ToNK
‑
lysin基因编码区的体外重组表达技术、活性重组蛋白的分离纯化、重组蛋白的细胞毒性作用及重组蛋白对大肠杆菌和哈维氏弧菌的抑菌作用研究。

技术介绍

[0002]河鲀(Pufferfish)因肉质白嫩、味道鲜美，深受消费者喜爱，具有较高的经济价值。目前野生河鲀资源日趋枯竭，养殖河鲀已成为主要来源。以“长江三鲜”之一著称的暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)是长江中下游特有的优质渔业种质资源，也是全国主要的淡水养殖河鲀品种，近年来病害频发和品质亟待提升等问题，严重阻抑了养殖业的健康绿色发展。
[0003]NK
‑
lysin蛋白是一种结构保守的抗菌肽，主要由细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTLs)和自然杀伤细胞(natural killer cells,NKs)分泌产生。NK
‑
lysin属于皂素样蛋白家族(saposin
‑
like protein family,SAPLIP)，N端序列包含六个高度保守的半胱氨酸残基，可以形成三个内二硫键。所有SAPLIP都有一个共同的折叠，称为saposin折叠，与NK
‑
lysin蛋白的抗菌活性有关。目前，NK
‑
lysin蛋白的抑菌作用在暗纹东方鲀中尚无报道。

技术实现思路
<br/>[0004]本专利技术提供一种暗纹东方鲀ToNK
‑
lysin基因的重组蛋白的制备和应用。
[0005]在ToNK
‑
lysin基因编码区的两端分别设计含有限制性酶切位点的引物，通过PCR技术，扩增编码区基因并将其克隆到pET
‑
30a表达载体中，随后转入宿主细胞Transetta(DE3)中实现原核体外重组表达。
[0006]暗纹东方鲀ToNK
‑
lysin基因的重组蛋白的氨基酸序列如下所示：
[0007]MPTSSILLLCILVTCSVWPVQARNLTVSTDDDDEHQGGFAIEAGRLPGVCWACKWALKKVKRIIGNSSTSQAIKAKLTSICDHIGLLKSLCRKFVTNHLGVLIEELTTSDDVRTSASTSGPASQRSWRSSPRVVFPHSHI
[0008]长度：139个氨基酸
[0009]类型：氨基酸
[0010]链型：单链
[0011]特性：分子量为15.3kDa，等电点为9.05，具有1个保守的SapB结构域。
[0012]重组产物经镍琼脂糖凝胶柱纯化，并且透析复性后，表现出以下活性：
[0013]ToNK
‑
lysin重组蛋白对河鲀头肾细胞没有细胞毒性作用，并能显著性地清除河鲀体内的哈维氏弧菌；
[0014]ToNK
‑
lysin重组蛋白能够降解大肠杆菌和哈维氏弧菌的基因组，并显著性地抑制它们的生长。
[0015]本专利技术所具有的优点：
[0016]本专利技术利用体外重组表达技术获得了暗纹东方鲀抗菌肽ToNK
‑
lysin蛋白，该重组蛋白对河鲀头肾细胞没有细胞毒性作用，并能显著性地清除河鲀体内的哈维氏弧菌；此外，ToNK
‑
lysin重组蛋白能够降解大肠杆菌和哈维氏弧菌的基因组，并显著性地抑制它们的生长。作为一种有效的免疫效应分子，ToNK
‑
lysin蛋白在开发抗菌类药物、新型免疫制剂以及饲料添加剂等方面具有潜在应用价值。
附图说明
[0017]附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：
[0018]图1：暗纹东方鲀NK
‑
lysin重组蛋白的SDS
‑
PAGE检测；
[0019]图2：暗纹东方鲀NK
‑
lysin重组蛋白对河鲀头肾细胞的细胞毒性实验；
[0020]图3：暗纹东方鲀NK
‑
lysin重组蛋白的体内病原菌清除实验；
[0021]图4：暗纹东方鲀NK
‑
lysin重组蛋白对大肠杆菌和哈维氏弧菌生长曲线的影响；
[0022]图5：暗纹东方鲀NK
‑
lysin重组蛋白对大肠杆菌基因组的降解情况；其中1.PBS+10μl基因组DNA；2.50ng+10μl基因组DNA；3.100ng+10μl基因组DNA；4.200ng+10μl基因组DNA；5.250ng+10μl基因组DNA；6.300ng+10μl基因组DNA；7.10μl基因组DNA；
[0023]图6：暗纹东方鲀NK
‑
lysin重组蛋白对哈维氏弧菌基因组的降解情况，其中1.PBS+10μl基因组DNA；2.50ng+10μl基因组DNA；3.100ng+10μl基因组DNA；4.200ng+10μl基因组DNA；5.250ng+10μl基因组DNA；6.300ng+10μl基因组DNA；7.10μl基因组DNA。
具体实施方式
[0024]以下结合附图对本专利技术的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0025]实施例1
[0026]暗纹东方鲀NK
‑
lysin(ToNK
‑
lysin)基因编码区的体外原核重组表达，包括下列步骤：
[0027]1.重组载体的构建
[0028]本实施例采用的重组载体为pET
‑
30a原核表达载体。通过PCR技术，采用5
’
末端分别添加了Kpn I和Xho 1特定酶切位点的基因特异性引物：
[0029]P1(5
’‑
CGGGGTACCATGCCAACCTCCTCGATCCT
‑3’
)
[0030]P2(5
’‑
CCGCTCGAGGTGAGAGTGAGGAAAAACCACTC
‑3’
)
[0031]反应条件为：首先94℃预变性5分钟，然后进入下列循环：94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共进行30个循环，最后72℃延伸10分钟。将扩增片段纯化回收，与pMD19
‑
T载体连接。转化后筛选阳性克隆，提取质粒；使用Kpn I和Xho 1两种限制性内切酶对质粒进行双酶切，用胶回收纯化试剂盒(大连宝生物工程有限公司)对酶切产生的目的片段纯化回收；回收目的片段与经Kpn I和Xho 1两种限制性内切酶酶切的表达载体pET
‑
30a连接，完成表达载体的构建。具体实验本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.暗纹东方鲀抗菌肽ToNK
‑
lysin，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.权利要求1所述的暗纹东方鲀抗菌肽ToNK
‑
lysin的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、构建暗纹东方鲀抗菌肽K
‑
lysin表达载体；采用5
’
末端分别添加了Kpn I和Xho 1特定酶切位点的基因特异性引物：P1(5
’‑
CGGGGTACCATGCCAACCTCCTCGATCCT
‑3’
)P2(5
’‑
CCGCTCGAGGTGAGAGTGAGGAAAAACCACTC
‑3’
)；反应条件为：首先94℃预变性5分钟，然后进入下列循环：94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共进行30个循环，最后72℃延伸10分钟；将扩增片段纯化回收，与pMD19
‑
T载体连接；转化后筛...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋小瑞，赵哲，史燕，杨亚星，崔楠，雷天影，
申请(专利权)人：河海大学，
类型：发明
国别省市：