检测马铃薯Y病毒用单克隆抗体及其应用制造技术

本申请公开了一种检测马铃薯Y病毒用单克隆抗体及其应用，其重链可变区包括：SEQ ID No.1所示的重链CDR1、SEQ ID No.2所示的重链CDR2和SEQ ID No.3所示的重链CDR3；轻链可变区包括：SEQ ID No.4所示的轻链CDR1、SEQ ID No.5所示的轻链CDR2和SEQ ID No.6所示的轻链CDR3。采用该单克隆抗体可以直接制成检测装置例如胶体金检测试纸条，用于大批量样品的快速检测，且该抗体制得的胶体金检测试纸条对PVY

【技术实现步骤摘要】
检测马铃薯Y病毒用单克隆抗体及其应用


[0001]本申请涉及烟草病毒检测
，特别是一种检测马铃薯Y病毒用单克隆抗体及其应用。

技术介绍

[0002]马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)是植物RNA病毒最大属马铃薯Y病毒属(Potyvirus)的代表种，可侵染包括：马铃薯、烟草、辣椒等在内多种茄科作物，也可以危害藜科、豆科等多种经济作物。PVY引起的症状因寄主品种和病毒株系的不同而有所差异，典型的症状包括重型花叶、叶脉坏死、垂叶条斑坏死等。
[0003]1931年Smith首次在马铃薯上发现PVY；20世纪50年代初，烟草PVY开始在欧洲广泛流行继而扩展到美洲，仅30年左右就在众多国家呈现大规模发生趋势，在烟草上已由次要病害转变为主要病害。在我国，最早于1950年发现该病毒病，近年来几乎遍布全国各地的烟草种植区，在四川、山东、辽宁、云南等烟区发病极重，给烟草农业造成了重大损失，经济损失已经超过其他真菌病害，并上升为对烟叶产量和质量危害程度最大的一种病害，威胁着烟叶的可持续生产。
[0004]目前常用的PVY检测方法主要有生物学检测法、电子显微镜检测法、分子生物学检测法和血清学检测法。生物学检测法和电子显微镜检测法都需要培养或制备合适的观察对象，耗时较长且结果判定较为主观，并不适用于快速检测。以高灵敏度为优点的RT
‑
PCR是近年来常用于PVY检测的分子生物学检测法，灵敏度高、特异性强，但在实际应用时对RNA的提取、cDNA的反转录要求较高，不适用于高通量样品检测。例如CN201110047406.1中公开的一种用于快速检测马铃薯Y病毒的试剂盒及检测方法。
[0005]血清学检测技术具有操作简便、快速、灵敏、特异等优点，在脱毒种植生产和田间调查中应用前景广阔。因此，制备特异性强、灵敏度高及专化性强的抗体，建立一套灵敏、快速的PVY血清学检测方法对该病毒的监控和防治具有重要的意义。
[0006]CN201610096251.3《分泌抗马铃薯Y病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用》中公开了利用差速离心法提纯的PVY病毒粒子为抗原免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、筛选、克隆，获得1株能稳定传代并分泌抗PVY单抗的杂交瘤细胞株3B2，其保藏号为CGMCC No.12001。该细胞株分泌单抗腹水间接ELISA效价达10e
‑
7，抗体类型及亚类为IgG1、kappa轻链，该单抗与30kDa的PVY外壳蛋白有特异反应。
[0007]但该方法采用杂交瘤细胞技术获得抗体，存在抗体分泌量下降及丢失的风险，而且该方法以细胞培养为起点，一旦细胞培养过程中发生污染或储存细胞丢失，都会导致相应抗体生产的中止。现有用于PVY病毒检测中所用试纸存在检测结果中，假阳性结果较多的问题。

技术实现思路

[0008]本申请针对上述技术问题提供了一种特异性强、灵敏度高且适用于烟草植株PVY
病毒检测的抗马铃薯Y病毒单克隆抗体及其应用，并通过测序获得其编码序列，获得该抗体编码序列后以重组蛋白的方式来稳定获得抗体，使得研发或生产不必以杂交瘤细胞为载体保留该抗体，而能够以碱基序列的形式进行保存，可以有效保证所得抗体的检测结果稳定性，而且准确的抗体序列信息也是后续抗体亲和力成熟、其他抗体改造的基础，有效降低检测结果的假阳性。
[0009]本申请提供了一种检测马铃薯Y病毒用单克隆抗体，其重链可变区包括：SEQ ID No.1所示的重链CDR1、SEQ ID No.2所示的重链CDR2和SEQ ID No.3所示的重链CDR3；
[0010]轻链可变区包括：SEQ ID No.4所示的轻链CDR1、SEQ ID No.5所示的轻链CDR2和SEQ ID No.6所示的轻链CDR3。
[0011]该单克隆抗体的重链可变区包括如SEQ ID No.1所示的重链CDR1：Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala；
[0012]SEQ ID No.2所示的重链CDR2：Ile Ser Ser Gly Gly Ser Thr；
[0013]SEQ ID No.3所示的重链CDR3：Ala Arg Tyr Gly Asn Leu Tyr Ala Met Asp Tyr。
[0014]该单克隆抗体的轻链可变区包括如SEQ ID No.4所示的轻链CDR1：Gln Ser Leu Val His Arg Asn Gly Asp Thr Tyr；
[0015]SEQ ID No.5所示的轻链CDR2：Arg Val Ser；
[0016]SEQ ID No.6所示的轻链CDR3：Ser Gln Ser Thr His Leu Pro Phe Thr。
[0017]具有上述互补决定区的氨基酸序列单克隆抗体，即可发挥对马铃薯Y病毒的有效检测。上述互补决定区内序列与抗原上的抗原决定簇结合，并在该位点发生特异性结合作用，抗原与该序列的抗体结合实现检测。
[0018]优选地，其重链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.7所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。
[0019]SEQ ID No.7：
[0020][0021]SEQ ID No.8：
[0022][0023]优选地，单克隆抗体的重链可变区编码基因DNA序列如序列表中SEQ ID No.9所示：单克隆抗体的轻链可变区编码基因DNA序列如序列表中SEQ ID No.10所示。
[0024]SEQ ID No.9：
[0025][0026]SEQ ID No.10：
[0027][0028]该单克隆抗体用于ELISA测定腹水效价时，达到了1:(2.187
×
10
‑7)。该抗马铃薯Y病毒单克隆抗体为IgG
1(κ)
。
[0029]本申请的另一方面还提供了一种马铃薯Y病毒检测用检测装置，包括：如上述单克隆抗体；所述检测装置为试剂盒或胶体金检测试纸条。
[0030]本申请提供的单克隆抗体可直接用于试剂盒结构中，实现大批量快速准确检测。
[0031]优选地，用于烟草植株中马铃薯Y病毒的检测。
[0032]优选地，在胶体金检测试纸条中的胶体金标记物中每毫升胶体金溶液添加5～50μg所述单克隆抗体。
[0033]优选地，胶体金检测试纸条制备方法包括以下步骤：单克隆抗体与胶体金溶液混合后，加入10％ BSA至BSA在该溶液中终浓度为1％后，进行静置、离心得到沉淀，用复溶缓冲液洗涤、重悬所得沉淀；
[0034]制备结合物释放垫、检测样品吸收垫、反应膜后，组装得到胶体金检测试纸条。
[0035]优选地，所用复溶缓冲液为含BSA的质量分数为0.1％～0.5％、蔗糖的质量分数2％～4％、pH 7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液。
[0036]优选地，胶体金检测试纸条使用方法包括以下步骤：将预处理的烟叶上清本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测马铃薯Y病毒用单克隆抗体，其特征在于，其重链可变区包括：SEQ ID No.1所示的重链CDR1、SEQ ID No.2所示的重链CDR2和SEQ ID No.3所示的重链CDR3；轻链可变区包括：SEQ ID No.4所示的轻链CDR1、SEQ ID No.5所示的轻链CDR2和SEQ ID No.6所示的轻链CDR3。2.根据权利要求1所述的检测马铃薯Y病毒用单克隆抗体，其特征在于，其重链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.7所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。3.根据权利要求1所述的抗马铃薯Y病毒单克隆抗体，其特征在于，单克隆抗体的重链可变区编码基因DNA序列如序列表中SEQ ID No.9所示：单克隆抗体的轻链可变区编码基因DNA序列如序列表中SEQ ID No.10所示。4.一种马铃薯Y病毒检测用检测装置，其特征在于，包括：如权利要求1～3中任一项所述的单克隆抗体；所述检测装置为试剂盒或胶体金检测试纸条。5.根据权利要求4所述的马铃薯Y病毒检测用检测装置，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王春琼，何声宝，杨飞，陈丹，孙浩巍，张轲，张晓伟，蔡洁云，彭丽娟，龙杰，魏佳，顾健龙，李郸，杨艺敏，
申请(专利权)人：云南省烟草质量监督检测站，
类型：发明
国别省市：