一株副干酪乳杆菌及其在发酵甲壳动物及昆虫外壳提取甲壳素中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一株副干酪乳杆菌及其在发酵甲壳动物及昆虫外壳提取甲壳素中的应用。该菌株名称为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)M

【技术实现步骤摘要】
一株副干酪乳杆菌及其在发酵甲壳动物及昆虫外壳提取甲壳素中的应用


[0001]本专利技术涉及微生物发酵法提取甲壳素领域，特别涉及一株副干酪乳杆菌及其在发酵甲壳动物及昆虫外壳提取甲壳素中的应用。

技术介绍

[0002]目前生产甲壳素的原料主要是各种甲壳动物的外壳，常见的包括各种虾壳、蟹壳、龙虾壳等；而昆虫(例如黑水虻、黄粉虫、蚕蛹等)外壳中也含有大量甲壳素，也可作为生产甲壳素的原料。目前工业上主要采用化学法提取甲壳素，即采用盐酸和氢氧化钠交替处理虾、蟹壳，脱除矿物质和蛋白质、脂质等杂质，得到甲壳素。化学法在生产中产生大量含有高浓度有机质的碱性废水，污染严重，因此，亟待开发绿色环保的新型甲壳素生产技术取代旧技术。
[0003]在此背景下，国内外开始研究采用乳酸菌发酵法提取虾、蟹壳中甲壳素，这种方法主要是利用各种乳酸菌或其他产酸菌将葡萄糖等转化为乳酸等有机酸，从而将原料中碳酸钙等矿物质溶解脱除；同时利用原料自身含有的蛋白酶，或添加的蛋白酶，或再经产蛋白酶的微生物发酵，将原料中的大部分蛋白质脱除，得到甲壳素。
[0004]目前发现的适于上述发酵过程的乳酸菌的营养要求均较高，一般需要利用虾壳、蟹壳等原料本身丰富的营养成分，有些菌种甚至还需额外添加酵母膏、蛋白胨等营养成分。例如，王琪鑫
[1](2021)采用嗜热链球菌和花椒芽孢杆菌发酵虾壳提取甲壳素，发酵过程中需额外添加酵母浸粉、蛋白胨等高成本成分，且在最优条件下矿物质脱除率仅为83.80％，蛋白质脱除率仅为68.89％。辛荣玉
[2](2020)采用嗜酸乳杆菌以及深海微小杆菌通过二步连续发酵虾壳提取甲壳素，其原料是未经水解的虾壳，发酵后矿物质脱除率为99.84％，蛋白质脱除率为91.60％。姜启兴等
[3](2015)采用植物乳杆菌发酵经机械采肉后的南极磷虾壳提取甲壳素，脱钙率仅为84.6％。黄璠
[4](2012)分别采用鼠李糖乳杆菌脱除虾壳中的钙盐，采用枯草芽孢杆菌脱除虾壳中的蛋白质，获得甲壳素，其原料为未经水解的虾壳，发酵中还添加了蛋白胨、酵母膏等高成本成分，如果先用鼠李糖乳杆菌发酵脱钙，再用枯草芽孢杆菌发酵脱蛋白，脱钙率为98.98％，脱蛋白率为85.45％；如果先用枯草芽孢杆菌发酵脱蛋白，再用鼠李糖乳杆菌发酵脱钙，则脱钙率大幅降低至88.24％，脱蛋白率为88.15％。可见，其所用鼠李糖乳杆菌在脱除了蛋白质的虾壳中产酸脱钙的效率显著下降，即使添加了酵母膏也不行。中国专利专利号为201110061309.8，名称为“一种利用嗜酸乳杆菌从虾头和虾壳中提取蛋白质和甲壳素的方法”以及专利号为200910040121.8，名称为“一种从虾头和虾壳中提取蛋白质和甲壳素的方法”中公开提取蛋白质和甲壳素的方法，但这两份专利中均须采用未经水解的虾壳。Duan等
[5](2012)、段杉等
[6](2009)、李磊等
[7](2011)以及刘斯雅等
[8](2011)发表的关于发酵法提取甲壳素的论文中所采用的乳酸菌也只能发酵未经水解的营养丰富的虾壳。
[0005]国外相关研究也均采用了未经水解的虾壳，例如Pacheco等
[9](2009)研究了利用
植物乳杆菌发酵虾壳、虾头回收虾青素和甲壳素；Cira等
[10](2002)利用乳杆菌发酵未经水解的虾壳、虾头，采用蔗糖作碳源，发酵96小时后体系pH仅降低至4.2～4.3。此外，还有大量文献，如Pallin
[11](2016)，Slizewska
[12](2020)，Wang
[13](2020)Ledesma
[14](1977)，Morishita
[15](1981)等，均表明乳杆菌属细菌(包括副干酪乳杆菌)的营养要求均较高，因为乳杆菌属细菌合成氨基酸和维生素的能力不强，需要从环境中摄取。
[0006]然而，目前发酵法提取甲壳素的技术尚不完善，存在几个问题：第一、发酵稳定性差，难以实现工业化生产。如前所述，目前用于发酵提取甲壳素的乳酸菌一般营养要求较高，需要较丰富的氨基酸、维生素等营养因子，因此发酵中需要利用原料中丰富的蛋白质等营养成分，这导致发酵稳定性较差，原因如下：1、原料中添加或污染的成分差别很大，在对虾等动物养殖过程中，可能使用各种抗生素、激素、药物等；养殖环境及饲料中也存在各种污染物和添加剂；在储运、加工过程中为达到防腐、护色等目的可能超量超范围使用添加剂(例如亚硫酸盐等)，甚至使用各种非法添加物等，这些成分大部分残留在上述动物外骨骼所包含的内脏、体液及少量肌肉组织中，显著抑制微生物的生长。2、原料固有成分不稳定，甲壳动物及昆虫外壳不同部位(例如头胸甲和腹甲)、批次、品种、季节等因素均会造成原料中各种成分的显著波动。3、原料在贮藏过程中可产生多种对微生物有害的成分，甲壳动物及昆虫外壳在贮藏过程中原料可能发生霉变、细菌性腐败、生虫、脂肪氧化及水解、褐变等变化，这些变化中产生的真菌毒素、细菌毒素、虫便、脂肪氧化产物、游离脂肪酸、单甘脂、褐变产物等均对微生物有害。上述原因导致乳酸菌发酵提取甲壳素的效果很不稳定，甚至失败，难以实现工业化生产。第二、发酵液中的蛋白质不易回收利用。未脱蛋白质的虾、蟹、龙虾壳及昆虫壳在发酵过程中蛋白质被蛋白酶(包括原料内源蛋白酶、外加蛋白酶，或微生物产生的蛋白酶)水解进入发酵液中；同时，原料中的矿物质被转化为乳酸钙等可溶性盐类也进入发酵液；发酵液中还有大量乳酸。蛋白质与大量盐类、乳酸等混合在一起，不易回收利用。第三、发酵成本较高，其原因为：(1)葡萄糖消耗量较大，发酵中葡萄糖不仅用于维持菌体生长；还转化为乳酸溶解碳酸钙等矿物质；此外，还需大量乳酸维持发酵体系足够低的pH。其中前二个方面的消耗是必须的，但第三方面的消耗则与发酵体系中蛋白质的浓度有很大关系，由于蛋白质具有较强的缓冲作用，蛋白质浓度越高则必须有更多乳酸才能维持足够低的pH值，这就导致葡萄糖的消耗量增加。(2)发酵中乳酸菌须利用原料中丰富的蛋白质等营养成分，甚至需要额外添加酵母膏、蛋白胨等高成本成分。因此，采用目前的乳酸菌菌种和方法不仅难以回收原料中的蛋白质，甚至还增加了酵母膏、蛋白胨等成分的成本。上述几个问题导致发酵法生产甲壳素的技术难以实现稳定的、规模化的工业化生产。
[0007]针对上述问题，一个可行的解决方案就是先采用蛋白酶水解去除原料中危害微生物发酵的成分和绝大部分蛋白质等，然后再发酵提取甲壳素。然而，经过水解和清洗的原料营养贫乏，绝大多数乳酸菌无法在其中大量生长，因此，只有找到能够在上述营养贫乏的原料中大量生长的乳酸菌才能实现上述方案。但迄今为止，未见报道能够发酵经过水解去除了大部分蛋白质等成分的虾壳、蟹壳、昆虫壳等原料提取甲壳素的乳酸菌菌种。
[0008]参考文献：
[0009][1]王琪鑫，2021，生物发酵法制备甲壳素的研究，青岛科技大学硕士学位论文.
[0010][2]辛荣玉，2020，基于微生物法建立虾壳中甲壳素绿色制备技术研究，青岛科技大学硕士学位论文....

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株副干酪乳杆菌，其特征在于：名称为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)M
‑
1，保藏编号为CCTCC NO：M 20221886，该菌株于2022年12月6日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心。2.一种培养权利要求1所述副干酪乳杆菌的方法，其特征在于，具体步骤为：将副干酪乳杆菌接种于培养基中，于10℃～45℃条件下进行培养。3.权利要求1所述的副干酪乳杆菌在发酵甲壳动物和/或昆虫外壳提取甲壳素中的应用。4.一种利用权利要求1所述副干酪乳杆菌发酵甲壳动物和/或昆虫外壳提取甲壳素的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)取甲壳动物和/或昆虫外壳原料，加水混匀后再加入蛋白酶或利用原料自身的内源蛋白酶进行水解，待水解结束后固液分离，并用水清洗沉淀，得到水解后的固体沉淀；(2)向水解后的固体沉淀中加入水和碳源，并灭菌，冷却后接种权利要求1所述的副干酪乳杆菌，于10～45℃条件下进行发酵，待发酵结束后固液分离发酵液和残渣，并用清水清洗残渣，干燥，得到甲壳素。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：...

【专利技术属性】
技术研发人员：段杉，缪小兰，贾丽，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：