一种用于快速鉴定irf2bpl突变系斑马鱼基因型的引物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于快速鉴定irf2bpl突变系斑马鱼基因型的引物，所述引物为3条2对引物，分别为F1、F2和R，F1序列如SEQ ID NO:1所示，F2序列如SEQ ID NO:2所示，R序列如SEQ ID NO:3所示。本发明专利技术还公开了所述引物在快速鉴定irf2bpl突变系斑马鱼基因型中的应用。本发明专利技术通过这3条2对引物的设计和实验方法，能够快速、高通量地鉴别irf2bpl突变系斑马鱼的基因型，当天即可判断基因型，并可同时进行多个样本检测，成本较低，准确度高，能有效提高irf2bpl突变系斑马鱼的筛选效率。本发明专利技术较之Sanger测序的方法，更加省时省力，且节约成本。且节约成本。且节约成本。

【技术实现步骤摘要】
一种用于快速鉴定irf2bpl突变系斑马鱼基因型的引物及其应用


[0001]本专利技术涉及基因分子鉴定
，具体涉及一种用于快速鉴定irf2bpl突变系斑马鱼基因型的引物及其应用。

技术介绍

[0002]斑马鱼相较于人类有85％疾病基因组相似度以及各项生理过程高度保守，是研究人类疾病的一个很有吸引力的动物模型。在前期的癫痫患者的全外显子组测序(WES)结果中，筛选到可能引起癫痫疾病的基因IRF2BPL(基因编号为：Gene ID:64207)，并随后构建了irf2bpl基因敲除斑马鱼癫痫模型(CN115058424A)。该斑马鱼癫痫模型具有一定潜在的科研和医疗价值，有望用于研究IRF2BPL突变与癫痫发病机制的关系及后续抗癫痫药物筛选。因此，有必要将该基因敲除斑马鱼建系和扩繁，而对该突变系斑马鱼的筛选工作则显得尤为重要。
[0003]前期构建的irf2bpl基因敲除斑马鱼突变形式为缺失7bp，基于Sanger测序的传统基因型鉴定方式比较费时费力，需要将每个包含突变位点序列的测序结果一一解读才能判断基因型。因此，有必要开发一种更加省时省力的基因型鉴定方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供了一种用于快速鉴定irf2bpl突变系斑马鱼基因型的引物及其应用，以解决现有技术的不足。
[0005]本专利技术采用以下技术方案：
[0006]本专利技术第一方面提供了一种用于快速鉴定irf2bpl突变系斑马鱼基因型的引物，所述引物为3条2对引物，分别为F1、F2和R，F1序列如SEQ ID NO:1所示，F2序列如SEQ ID NO:2所示，R序列如SEQ ID NO:3所示。
[0007]本专利技术第二方面提供了上述引物在快速鉴定irf2bpl突变系斑马鱼基因型中的应用。
[0008]进一步地，包括如下步骤：以同一个待测irf2bpl突变系斑马鱼的基因组为模板，使用两个PCR扩增体系进行PCR扩增反应，其中第一个PCR扩增体系为F1和R，第二个PCR扩增体系为F2和R；PCR扩增反应结束后将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳结束后利用凝胶成像系统进行拍照，得出电泳图谱结果进行判断基因型：如果F1和R扩增出条带而F2和R没有扩增出条带，则待测斑马鱼基因型为野生型；如果F1和R没有扩增出条带而F2和R扩增出条带，则待测斑马鱼基因型为纯合突变体；如果F1和R扩增出条带，同时F2和R也扩增出条带，则待测斑马鱼基因型为杂合子。
[0009]更进一步地，PCR扩增体系中：上游引物F1或F2加入1μL，下游引物R加入1μL，2
×
Rapid Taq Master Mix加入10μL，ddH2O加入7μL，模板DNA加入1μL，总反应体系为20μL体系。
[0010]更进一步地，PCR扩增反应条件为：预变性95℃5min；35个循环：变性95℃15s，退火56℃15s，延伸72℃15s；再72℃7min。
[0011]本专利技术的有益效果：
[0012]本专利技术通过分析irf2bpl突变体与野生型序列的不同，设计筛选了3条2对引物，对同一个待测irf2bpl突变系斑马鱼的基因组模板进行2个PCR体系扩增，从PCR产物中得到野生型等位基因片段或/和突变型等位基因片段，通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，从而判断该基因组模板对应的斑马鱼的基因型：野生型、纯合突变体和杂合子。通过这3条2对引物的设计和实验方法，能够快速、高通量地鉴别irf2bpl突变系斑马鱼的基因型，当天即可判断基因型，并可同时进行多个样本检测，成本较低，准确度高，能有效提高irf2bpl突变系斑马鱼的筛选效率。本专利技术较之Sanger测序的方法，更加省时省力，且节约成本。
附图说明
[0013]图1为irf2bpl野生型等位基因、突变型等位基因部分序列，F1、F2和R引物位置及序列。
[0014]图2为F3、F4和F5引物位置及序列。
[0015]图3为F5和R扩增体系扩增结果电泳图。
[0016]图4为16尾irf2bpl F2代基因型鉴定电泳图。
[0017]图5为2号斑马鱼(irf2bpl F2代斑马鱼野生型)测序峰图。
[0018]图6为4号斑马鱼(irf2bpl F2代斑马鱼纯合突变体)测序峰图。
[0019]图7为1号斑马鱼(irf2bpl F2代斑马鱼杂合子)测序峰图。
具体实施方式
[0020]实施例1
[0021]1)设计引物，前期构建的irf2bpl基因敲除斑马鱼的突变形式为在第1号外显子上缺失7bp，如图1所示，突变等位基因的部分序列为“ACGGAGCCCGTGTGCAGGGGTTGCGT
‑‑‑‑‑‑‑
GAGGGCGCGGAT”，其中
“‑”
表示缺失，缺失的序列为“GAATTAC”。先确定上游引物设计在突变位置上，下游引物设计在距离上游引物约370bp的位置上。
[0022]上游引物设计两条，第一条为F1，第二条为F2，下游引物设计一条，为R，如图1。引物F1和R能够扩增野生型等位基因片段，而不能扩增突变型等位基因片段；引物F2和R能够扩增突变型等位基因片段，而不能扩增野生型等位基因片段。通过这3条2对引物对同一个待测irf2bpl突变系斑马鱼的基因组模板进行扩增，以此来达到鉴定基因型的目的。其中F1的序列为：“GCAGGGGTTGCGTGAATTAC”(5
’→3’
)，该引物的3
’
端位于突变位点里面，使用该引物和R引物进行PCR扩增时，只会结合到野生型等位基因上并延伸；而对于突变型等位基因，该引物的3
’
端不能与之碱基互补配对而不会产生扩增。F2的序列为：“TGTGCAGGGGTTGCGTGAG”(5
’→3’
)，该引物跨过突变序列，且与突变位点之后的3个碱基能够碱基互补配对，使用该引物和R引物进行PCR扩增时，只会结合到突变型等位基因上并延伸；而对于野生型等位基因，该引物的3
’
端不能与之碱基互补配对而不会产生扩增。R引物的序列为“TCGGGCTCTGTCGGTTAAGC”(5
’→3’
)。
[0023]2)上游引物第二条，我们同时还设计了F3、F4和F5，如图2。F3的序列为：
“
TGTGCAGGGGTTGCGTG”(5
’→3’
)，该引物3
’
端跨过突变序列，且与突变位点之后的1个碱基能够碱基互补配对，但是突变序列第一个碱基恰巧为“G”，因此该引物不能达到只扩增突变等位基因的效果；F4的序列为“TGTGCAGGGGTTGCGTGA”(5
’→3’
)，该引物3
’
端跨过突变序列，且与突变位点之后的2个碱基能够碱基互补配对，但是突变序列第一二个碱基恰巧为“GA”，因此该引物也不能达到只扩增突变等位基因的效果；F5的序列为“TGTGCAGGGGTTGC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于快速鉴定irf2bpl突变系斑马鱼基因型的引物，其特征在于，所述引物为3条2对引物，分别为F1、F2和R，F1序列如SEQ ID NO:1所示，F2序列如SEQ ID NO:2所示，R序列如SEQ ID NO:3所示。2.权利要求1所述引物在快速鉴定irf2bpl突变系斑马鱼基因型中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：以同一个待测irf2bpl突变系斑马鱼的基因组为模板，使用两个PCR扩增体系进行PCR扩增反应，其中第一个PCR扩增体系为F1和R，第二个PCR扩增体系为F2和R；PCR扩增反应结束后将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳结束后利用凝胶成像系统进行拍照，得出电泳图谱结果进行判断基因型：如果F1和R扩...

【专利技术属性】
技术研发人员：王爽，刘乐，刘静，
申请(专利权)人：苏州赛美科基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：