一种重组抗菌肽PMAP-37及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种重组抗菌肽PMAP

【技术实现步骤摘要】
一种重组抗菌肽PMAP
‑
37及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及到一种重组抗菌肽PMAP
‑
37及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]抗菌肽具有小分子量，广谱抑菌性及优良的稳定性等优点，具有抗菌、抗病毒、抗癌、促进免疫调节等多种作用，在生物医药、畜牧业、农业、食品等行业都具有潜在的应用前景。PMAP
‑
37抗菌肽来源于猪骨髓细胞，由37个氨基酸组成，对革兰氏阴性及阳性菌均有抑制作用，稳定性较好，在未来拥有良好应用前景。
[0003]然而利用生物自身合成抗菌肽的方法合成率太低，传统的天然提取PMAP
‑
37的方法效率低下，会消耗大量财力，无法获得所需用量。
[0004]目前，尚无在酵母细胞中高效表达重组PMAP
‑
37抗菌肽的报道。

技术实现思路

[0005]本部分的目的在于概述本专利技术的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和专利技术名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和专利技术名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本专利技术的范围。
[0006]鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本专利技术。
[0007]因此，本专利技术的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种重组抗菌肽PMAP
‑
37。
[0008]为解决上述技术问题，本专利技术提供了如下技术方案：一种重组抗菌肽PMAP
‑
37，所述重组抗菌肽氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0009]作为本专利技术所述重组抗菌肽PMAP
‑
37的一种优选方案，其中：所述重组抗菌肽碱基序列如SEQ ID NO:2所示。
[0010]本专利技术的再一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种重组抗菌肽PMAP
‑
37的制备方法。
[0011]为解决上述技术问题，本专利技术提供了如下技术方案：一种重组抗菌肽PMAP
‑
37的制备方法，包括，通过酵母菌高效表达获得所述重组抗菌肽PMAP
‑
37。
[0012]作为本专利技术所述重组抗菌肽PMAP
‑
37制备方法的一种优选方案，其中：包括，表达载体重组：
[0013]将SEQ ID NO:2所示PMAP
‑
37目的基因进行合成，并连接于pPICZα
‑
A载体上构成重组质粒pPICZα
‑
PMAP
‑
37
‑
A；
[0014]重组菌株构建：
[0015]用SacI内切酶线性化重组后的质粒pPICZα
‑
PMAP
‑
37
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A，并将处理后的质粒转入毕赤酵母GS115中，获得带有目的基因的重组菌株；
[0016]表达抗菌肽：
[0017]筛选出pPICZα
‑
PMAP
‑
37
‑
A的阳性转化子进行诱导表达，收取发酵后的上清液，获
得高浓度抗菌肽。
[0018]作为本专利技术所述重组抗菌肽PMAP
‑
37制备方法的一种优选方案，其中：所述PMAP
‑
37目的基因片段是将PMAP
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37抗菌肽原始序列根据酵母表达系统偏好性进行密码子优化，在N端依次加入EcoRI，起始密码子ATG，6个组氨酸标签，以及GATGATGATGATAAG15个碱基，C端依次加入终止密码子TAA及XbaI获得。
[0019]作为本专利技术所述重组抗菌肽PMAP
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37制备方法的一种优选方案，其中：所述诱导表达，包括，经1.5％的甲醇诱导，最佳表达时间为5d。
[0020]本专利技术的另一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种重组抗菌肽PMAP
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37在制备抗菌剂中的应用，所述重组抗菌肽PMAP
‑
37对金黄色葡萄球菌、大肠埃希、大肠O157、沙门氏菌和单增李斯特菌最小抑菌浓度为0.24μg/mL，对枯草芽孢杆菌最小抑菌浓度为0.12μg/mL。
[0021]本专利技术的其中一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种重组抗菌肽PMAP
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37在制备红李抗菌剂中的应用。
[0022]本专利技术有益效果：
[0023](1)本专利技术抗菌肽PMAP
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37是根据数据库筛选出的抗菌肽基因，并进行毕赤酵母密码子优化后插入pPICZαA中，最后经甲醇诱导表达而得；所得重组抗菌肽活性较好，并且具受温度、pH及酶的影响较小，稳定性较好，能广谱抑菌，在食品保鲜、植物防病害等方面有较好的应用前景。
[0024](2)本专利技术对PMAP
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37抗菌肽进行了改造，重组后，目的基因经过热击转入酵母细胞中，首次以毕赤酵母作为表达载体，获得所需高效表达重组PMAP
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37酵母菌株，并进行抑菌、稳定性及应用的研究，确定其对致病菌沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等有很强的抑菌作用，同时能明显地延缓红李的腐败；经检索本专利技术相关信息在国内外未见公开报道，在国内外未见公开使用。
[0025](3)本专利技术获得的重组抗菌肽PMAP
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37所用的菌株为巴斯德毕赤酵母，该表达系统具有优点：毕赤酵母载体上含有醇氧化酶启动子，可受甲醇调控；毕赤酵母对于营养的要求低，价格低廉，并且产量高，所产的抗菌肽可分泌到胞外，不似原核载体要细胞破碎，对于操作者来说简便不少，分泌的蛋白也多为目的蛋白，便于纯化；毕赤酵母遗传性状较稳，不易丢失基因，还可对翻译后的基因进行糖基化、蛋白磷酸化等修饰，使得修饰后的肽带有活性。
附图说明
[0026]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
[0027]图1为本专利技术实施例中抗菌肽基因PMAP
‑
37的PCR跑胶示意图；其中，a
‑
c为含有目的基因的三株阳性克隆。
[0028]图2为本专利技术实施例中重组抗菌肽PMAP
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37Westernblot示意图。
[0029]图3为本专利技术实施例中重组抗菌肽PMAP
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37的抑菌实验示意图；其中，a为阳性对照
庆大霉素(50μg/mL)；b为重组抗菌肽PMAP
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37200mg/mL冻干粉溶液，c为阴性对照SC3。
[0030]图4为本专利技术实施例中重组抗菌肽PMAP
‑
37稳定性实验示意图；其中，A为温度稳本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组抗菌肽PMAP
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37，其特征在于：所述重组抗菌肽氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.如权利要求1所述重组抗菌肽PMAP
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37，其特征在于：所述重组抗菌肽碱基序列如SEQ ID NO:2所示。3.权利要求1或2所述重组抗菌肽PMAP
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37的制备方法，其特征在于：包括，通过酵母菌高效表达获得所述重组抗菌肽PMAP
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37。4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：包括，表达载体重组：将SEQ ID NO:2所示PMAP
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37目的基因进行合成，并连接于pPICZα
‑
A载体上构成重组质粒pPICZα
‑
PMAP
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37
‑
A；重组菌株构建：用SacI内切酶线性化重组后的质粒pPICZα
‑
PMAP
‑
37
‑
A，并将处理后的质粒转入毕赤酵母GS115中，获得带有目的基因的重组菌株；表达抗菌肽：筛选出pPICZ...

【专利技术属性】
技术研发人员：董春明，许丽君，张瑞，赵国忠，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：