一种应激性肝郁脾虚型斑秃样小鼠模型的制备方法及应用技术

本发明专利技术涉及斑秃动物模型技术领域，具体为一种应激性肝郁脾虚型斑秃样小鼠模型的制备方法及应用。具体方法为：将若干小鼠随机分为空白对照组及模型组；第1~11天，对照组小鼠无特殊处理；第12天开始模型组使用咪喹莫特乳膏涂抹于小鼠背部，面积1.5cm

【技术实现步骤摘要】
一种应激性肝郁脾虚型斑秃样小鼠模型的制备方法及应用


[0001]本专利技术涉及斑秃动物模型
，特别是涉及一种应激性肝郁脾虚型斑秃样小鼠模型的制备方法及应用。

技术介绍

[0002]斑秃是一种常见的脱发疾病，临床以突发性斑片状脱发为特征，受累处皮肤无炎症及瘢痕。受累部位除头皮毛发外，也可累及身体其他多毛区域，如眉毛、睫毛、胡须、腋毛和阴毛。该病是一种常见的损美性皮肤病，往往给患者造成极大的心理压力，可发生于各个年龄段，并以青少年期为高发。精神心理因素是斑秃的发生发展的重要病因之一，而毛发的缺失又可增加患者精神心理负担，继而进一步加剧斑秃，形成恶性循环。精神应激因素所致斑秃与中医肝郁脾虚型斑秃具有极大相似性，提示对斑秃的治疗应重视肝脾。
[0003]因此，建立有效的斑秃动物模型对该病的深入研究具有重要意义。目前斑秃动物模型的制备方法主要有以下几种：
①
1994年Sundberg等人发现C3H/HeJ雌鼠可出现自发斑秃表现，与人类斑秃具有高度相似性，但其模型周期长、成功率低，5月龄的C3H/HeJ雌鼠成功率仅为0.25%，经过复杂的育种和长期培育成功率为20%，难以满足大多数实验需求。
[0004]②
1998年McElwee等人发现通过移植自发斑秃的皮损全层皮肤到10周龄C3H/HeJ雌鼠，可以加速脱发表型的发生，但该方法技术要求高，并依赖于自发的斑秃小鼠，不适于大规模应用。
[0005]③
2003年McElwee等人将自发斑秃小鼠的淋巴结细胞在IL/>‑
7和IL
‑
15条件下培养后，通过移植到C3H/HeJ幼鼠可诱导斑秃表型，但此移植方法对技术要求高，并依赖于自发的斑秃小鼠，故在大规模应用上仍存在困难。
[0006]④
2005年Gilha等人发现静脉注射IFN
‑
γ于C3H/HeJ小鼠可诱导出与人类相似的斑秃动物模型，但鼠源IFN
‑
γ价格昂贵，并且有研究发现重复性不佳。
[0007]⑤
2009年赵恒光等人使用局部外用咪喹莫特乳膏的方法，对四种品系小鼠（BARB/c小鼠、129小鼠、C57小鼠、C3H/HeJ小鼠）建立了稳定的脱毛模型，成功率近100%，但未观察到毛囊周围明显炎症细胞浸润。
[0008]由此可见，现有的斑秃造模方法均存在一定的不足之处，探索建立一种更简便有效、更符合人类斑秃发病机制、更贴近人类斑秃表现、更能反映中医证型的斑秃造模方法具有重要临床及科研意义。

技术实现思路

[0009]本专利技术要解决的技术问题是提供一种应激性肝郁脾虚型斑秃样小鼠模型的制备方法及应用。
[0010]为了解决上述技术问题，本申请提供了如下技术方案：一种应激性肝郁脾虚型斑秃样小鼠模型的制备方法：将若干小鼠随机分为空白对
照组及模型组；第1~11天，对照组小鼠无特殊处理；第12天开始模型组使用咪喹莫特乳膏涂抹于小鼠背部，面积1.5cm
×
2cm，对照组则使用凡士林乳膏，两组均连续涂抹7天；第19天后停止涂抹，观察小鼠脱毛情况；第21天进行拍照、取材；其中，实验过程中，模型组持续应激21天，制备慢性不可预知温和应激模型。
[0011]进一步的，所述小鼠为C57BL/6J或C3H/HeJ小鼠。
[0012]进一步的，模型组采用的局部外用药物为咪喹莫特乳膏，应激因子包括倾斜鼠笼、潮湿垫料、夹尾、束缚、禁食水、频闪、游泳。
[0013]进一步的，第21天对小鼠进行取材，具体方法为：小鼠麻醉后，眼眶静脉丛取血法采集小鼠外周血，置于EDTA抗凝管；选取背部皮肤，面积1.5cm
×
2cm，置于组织固定液中充分浸泡，准备石蜡包埋切片。
[0014]本专利技术所述制备方法获得的应激性肝郁脾虚型斑秃样小鼠模型可用于筛选治疗应激性斑秃或肝郁脾虚型斑秃相关药物。
[0015]与现有技术相比，本专利技术的应激性肝郁脾虚型斑秃样小鼠模型的制备方法及应用至少具有以下有益效果：（1）本专利技术应激性肝郁脾虚型斑秃样小鼠模型的制备方法突出了精神应激因素在斑秃发病中的作用，更接近人类应激性斑秃发病机制，同时也符合中医肝郁脾虚证表现 。
[0016]（2）本专利技术方法在前人单纯外用咪喹莫特的基础上，联合慢性不可预知温和应激的目的即是为了更好地模拟人类在社会生活中所受到的精神应激特征（长期、慢性、低强度、多变的压力刺激）。而模型组小鼠精神萎靡、体重下降以及行为学测定所展现的绝望抑郁状态，首先可说明应激模型制备成功，其次也充分验证了精神应激因素作为重要一环参与了斑秃的发生发展。
[0017]随着实验进行，模型组小鼠逐渐出现精神萎靡、活动减少、喜蜷缩于角落、大便时不成形、体重增长缓慢、进行应激时挣扎抵抗减少等表现，此为慢性应激日久，导致肝气郁结、木胜乘土，从而出现的肝郁脾虚之象。由此说明，该模型亦符合中医肝郁脾虚证表现。
[0018]（3）本专利技术方法的造模成功率高，可重复性强 。
[0019]在实验后期，最终存活的8只模型组C57BL/6J小鼠背部均出现斑秃样脱毛区域，一般情况、行为学指标亦均符合应激模型表现。此外，专利技术人研究团队将该造模方法应用于C3H/HeJ小鼠，亦成功制备了斑秃表现与应激状态兼有的小鼠模型。说明本专利技术方法造模成功率较高，可重复性强。
[0020]（4）另外，C57BL/6J小鼠价格较低，培育方便，性价比高；与之相反的，若使用C3H/HeJ小鼠则无此优势。
[0021]（5）本专利技术方法所制备的模型，通过检测相关指标（如下丘脑
‑
垂体
‑
肾上腺轴指标），可进一步探究精神应激因素参与斑秃发病的具体分子机制。此外，还可用于验证相关药物（西药、中药或中成药）对应激性斑秃或者肝郁脾虚型斑秃的治疗效果及作用靶点。
[0022]下面结合附图对本专利技术的应激性肝郁脾虚型斑秃样小鼠模型的制备方法及应用作进一步说明。
附图说明
[0023]图1为游泳、倾斜鼠笼应激照片；
图2为小鼠毛发生长情况对比；图3为皮肤组织CD4、CD8免疫组化染色（
×
200）；图4为小鼠外周血Th1、Th2、Th17、Treg细胞流式图；图5为各组小鼠毛发生长情况对比；图6为各组小鼠Western blot检测海马体GR、BDNF表达。
具体实施方式
[0024]一、材料1、实验动物5~7周龄，体重16~20g的C57BL/6J或C3H/HeJ雌性健康小鼠20只，饲养于SPF级动物房，动物实验获伦理委员会批准。
[0025]2、药品及试剂表1 药品及试剂
[0026]3、实验仪器及耗材表2 实验仪器及耗材
[0027]二、模型制备方法1、动物适应性喂养室温22～25℃，相对湿度50%～70%，昼夜光照恒定12h/12h，自由饮水、进食。适应性饲养7天后进行实验。
[0028]2、模型制备方本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种应激性肝郁脾虚型斑秃样小鼠模型的制备方法，其特征在于：将若干小鼠随机分为空白对照组及模型组；第1~11天，对照组小鼠无特殊处理；第12天开始模型组使用咪喹莫特乳膏涂抹于小鼠背部，面积1.5cm
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2cm，对照组则使用凡士林乳膏，两组均连续涂抹7天；第19天后停止涂抹，观察小鼠脱毛情况；第21天进行拍照、取材；其中，实验过程中，模型组持续应激21天，制备慢性不可预知温和应激模型。2.根据权利要求1所述的应激性肝郁脾虚型斑秃样小鼠模型的制备方法，其特征在于：所述小鼠为C57BL/6J或C3H/HeJ小鼠。3.根据权利要求2所述的应激性肝郁脾虚型斑秃样小...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨顶权，曲保全，吕书影，林文君，
申请(专利权)人：中日友好医院中日友好临床医学研究所，
类型：发明
国别省市：