一种生物酶制备β-烟酰胺单核苷酸的方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，公开了一种生物酶制备β

【技术实现步骤摘要】
一种生物酶制备
β
‑
烟酰胺单核苷酸的方法


[0001]本专利技术属于生物
，涉及酶法催化生成烟酰胺单核苷酸的方法，具体是一种生物酶制备β
‑
烟酰胺单核苷酸的方法。

技术介绍

[0002]β
‑
烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide mononucleotide，缩写NMN)是生物细胞内存在的一种生化物质，它在β
‑
烟酰胺核苷酸腺苷转移酶腺苷化后即转化成细胞赖以生存的重要物质烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD，又称辅酶Ⅰ)，并且同时直接参与体内的腺苷转移，其在生物细胞内的水平直接影响到NAD的浓度，在生物细胞能量生成扮演着重要角色，并且对人体无危害。
[0003]截至目前，人们已经发现烟酰胺单核苷酸具有诸如延缓衰老、治疗帕金森等老年病、调节胰岛素分泌、影响mRNA的表达等诸多医疗保健作用，更多的用途还在不断研发出来，随着人们对烟酰胺单核苷酸药用及保健效果认知的增加，以及作为一种反应底物在化工方面的广泛应用，市场上对烟酰胺单核苷酸的需求与日俱增。
[0004]目前NMN的制备方法主要包括以下三种：1.酵母发酵法，2.化学合成法，3.生物酶催化法。其中，化学合成法具有成本较高且产生手性化合物的缺点；而酵母菌发酵法生产的NMN含一定的有机溶剂残留；生物催化法因不含有机溶剂的残留，也不存在手性问题且制备的NMN与机体内的同型而成为目前最绿色环保无公害的NMN制备方法。现有的制备NMN的生物催化法主要有两条途径。一是以烟酰胺核糖(NR)为起始原料，在ATP的存在下，由烟酰胺核糖激酶(NRK)催化生成NMN。目前报道的该路线NMN产量均较低，且底物原料昂贵；二是以烟酰胺和5
‑
磷酸核糖
‑1‑
焦磷酸(PRPP)为底物在烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nicotinamide phosphoribosyltransferase,缩写NAMPT)催化下制备NMN，其中PRPP市场价格昂贵且来源受限，导致该生物催化法的生产成本较高，严重制约了其应用和发展。
[0005]因此有必要开发一种使用低成本底物的高效生物催化技术来制备NMN的新方法。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种多酶催化合成β
‑
烟酰胺单核苷酸的方法，以D
‑
核糖、烟酰胺和腺嘌呤核苷三磷酸ATP、腺嘌呤核苷二磷酸ADP或腺嘌呤核苷单磷酸AMP三者中一种为原料，在核糖激酶RK、磷酸核糖焦磷酸激酶PRS以及烟酰胺磷酸核糖转移酶NAMPT偶联催化下使用一锅法制备NMN，同时引入多聚磷酸激酶PPK2Ⅲ和多聚磷酸盐实现ATP的循环再生，再进一步降低生产成本。
[0007]为实现上述专利技术目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0008]一种酶法制备β
‑
烟酰胺单核苷酸的方法，所述方法以多聚磷酸盐、烟酰胺、D
‑
核糖、ATP为底物，以多聚磷酸激酶、核糖激酶、磷酸核糖焦磷酸激酶、烟酰胺磷酸核糖转移酶催化合成β
‑
烟酰胺单核苷酸NMN，同时ATP循环再生。
[0009]上述技术方案中，进一步地，所述底物中ATP替换为ADP或AMP；优选地，ADP或AMP等
量替换ATP。
[0010]上述技术方案中，进一步地，所述核糖激酶RK来源于大肠杆菌，核糖激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示(E.coli来源)；
[0011]所述磷酸核糖焦磷酸激酶PRS来源于大肠杆菌，磷酸核糖焦磷酸激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示(E.coli来源)；
[0012]所述烟酰胺磷酸核糖转移酶NAMPT源于人，烟酰胺磷酸核糖转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示(Homo sapiens来源)；
[0013]所述多聚磷酸激酶PPK2Ⅲ源于亚栖热菌，多聚磷酸激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示(Meiothermus ruber来源)。
[0014]上述技术方案中，进一步地，所述催化合成反应温度为20
‑
50℃，优选为30
‑
40℃；反应pH为6.5
‑
8.5，优选为7.5
‑
8.0。
[0015]上述技术方案中，进一步地，所述催化合成反应在PBS缓冲液或Tris
‑
HCl缓冲液中进行；优选PBS缓冲液；所述PBS缓冲液或Tris
‑
HCl缓冲液浓度为50mM。
[0016]上述技术方案中，进一步地，所述3种底物D
‑
核糖、ATP、烟酰胺的摩尔比为1：1
‑
5：1
‑
5，按此配比投放原料使D
‑
核糖充分反应，D
‑
核糖转化率达到90％
‑
100％；优选1：1
‑
2：1
‑
3，D
‑
核糖转化率达到100％；添加所述核糖激酶酶量为3mg/L，磷酸核糖焦磷酸激酶酶量为0.35mg/L，烟酰胺磷酸核糖转移酶酶量为1.8g/L，多聚磷酸激酶酶量为1mg/L。
[0017]上述技术方案中，进一步地，反应体系中加入辅酶因子Mg
2+
和K
+
，辅酶因子Mg
2+
浓度为5
‑
50mM，K
+
浓度为50
‑
150mM，Mg
2+
和K
+
来自于氯化镁、硫酸镁、亚硫酸镁、硝酸镁、氯化钾、硫酸钾、硝酸钾中的一种或多种。
[0018]上述技术方案中，进一步地，所述多聚磷酸盐选自三聚磷酸钠、三聚磷酸钾、六偏磷酸钠、六偏磷酸钾、四偏磷酸钾、四偏磷酸钠中的一种或多种，优选为六偏磷酸钠，在体系中过量存在。
[0019]上述技术方案中，进一步地，所述核糖激酶RK、磷酸核糖焦磷酸激酶PRS、烟酰胺磷酸核糖转移酶NAMPT、多聚磷酸激酶PPK2Ⅲ的表达宿主为微生物，所述微生物为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母中的至少一种，优选大肠杆菌，进一步优选大肠杆菌BL21(DE3)。微生物中酶的重组表达载体为本领域常规的各种载体，包括：各种质粒、粘粒、噬菌体和病毒载体中的至少一种，如pET28a(+)、柯斯质粒载体、λ噬菌体载体，优选原核表达载体pET28a(+)。
[0020]上述技术方案中，进一步地，所述核糖激酶RK、磷酸核糖焦磷酸激酶PRS、烟酰胺磷酸核糖转移酶NAMPT、多聚磷酸激酶PPK2Ⅲ具体存在形式包括酶液、酶冻干粉、含酶细胞以及固定化酶和固定化含酶细胞，未经纯化的粗酶，或是经过部分纯化、完全纯化的形式，优选纯化酶液。
[0021]本专利技术的反应过程如下：D
‑
核糖和ATP在核糖激酶RK作用下先合成5磷酸核糖R
‑5‑
P，然后再与ATP经本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酶法制备β
‑
烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：所述方法以多聚磷酸盐、烟酰胺、D
‑
核糖、ATP为底物，以多聚磷酸激酶、核糖激酶、磷酸核糖焦磷酸激酶、烟酰胺磷酸核糖转移酶催化合成β
‑
烟酰胺单核苷酸，同时ATP循环再生。2.根据权利要求1所述的一种酶法制备β
‑
烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：所述底物中ATP替换为ADP或AMP；优选地，ADP或AMP等量替换ATP。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述核糖激酶来源于大肠杆菌，核糖激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述磷酸核糖焦磷酸激酶来源于大肠杆菌，磷酸核糖焦磷酸激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述烟酰胺磷酸核糖转移酶来源于人，烟酰胺磷酸核糖转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述多聚磷酸激酶源于亚栖热菌，多聚磷酸激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述催化合成反应温度为20
‑
50℃，优选为30
‑
40℃；反应pH为6.5
‑
8.5，优选为7.5
‑
8.0。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述催化合成反应在PBS缓冲液或Tris
‑
HCl缓冲液中进行；优选PBS缓冲液；所述缓冲液浓度为50mM。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述3种底物D
‑
核糖、ATP、烟酰胺的摩尔比为1：1
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛松，李宏文，冯延宾，史建平，李祥龙，冯婷，李鸿飞，蒋昕珊，朱小妮，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：