抗细胞凋亡的细胞系制造技术

本公开涉及真核细胞系，其具有在Bax基因和Bak基因中的每一者中的稳定整合的功能丧失突变或功能衰减突变。还提供了生产此类细胞系的方法。本公开还涉及包含此类细胞系的组合物和细胞培养物，以及使用所述细胞、组合物和细胞培养物生产诸如重组多肽或病毒载体等产物的方法。的方法。的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】抗细胞凋亡的细胞系
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2020年6月24日提交的美国临时申请号63/043,545和2021年6月15日提交的美国临时申请号63/210,640的优先权，这些临时申请的内容通过引用方式整体并入本文。


[0003]本公开涉及在Bax基因和Bak基因中的每一者中具有稳定整合的功能丧失突变或功能衰减突变的真核细胞系。还提供了生产此类细胞系的方法。本公开还涉及包含所述细胞的组合物和细胞培养物，以及生产产物如重组多肽或病毒载体的方法，以及所述细胞、组合物和细胞培养物在生产目的产物的方法中的用途。

技术介绍

[0004]单克隆抗体(mAb)和其他重组蛋白已被确定为许多疾病适应症的成功疗法，包括免疫学、肿瘤学、神经科学等(参见，例如，Reichert(2017)mAbs.9:167
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181；Singh等人(2017)Curr.Clin.Pharmacol.13:85
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99)。生物技术行业正在开发300多种mAb，预计到2020年mAb市场将扩大到70种mAb产物(Ecker等人(2015)mAbs.7:9
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14)。随着行业的扩展和靶标变得更加复杂，需要更大规模的抗体发现活动来筛选多个mAb变体并确定具有所需特征的临床候选物。
[0005]真核细胞，例如哺乳动物细胞(例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)，已被广泛用于生产用于临床应用的治疗性蛋白质，例如mAb，因为它们具有适当的蛋白质折叠、组装和转译后修饰的能力。然而，大量进行所需分子的细胞培养和生产具有挑战性。因此，需要提供改进的细胞和方法以进一步优化所需产物(例如治疗性蛋白质)的生产。

技术实现思路

[0006]仍然需要用于培养真核细胞系，例如哺乳动物细胞系(例如，CHO细胞系)的最佳方法，以生产目的产物，例如重组多核苷酸或重组多肽。我们已经确定，当细胞系用于生产目的产物时，细胞表现出高生存力是有利的(例如提供更好的产物滴度)。因此，需要具有抗细胞凋亡的细胞系，包括哺乳动物细胞系(例如CHO细胞系)，以便在生物反应器中提供比其野生型对应物更高的生产率和更稳健的性能。
[0007]为了满足这些和其他需求，本文提供真核细胞系，例如哺乳动物细胞系(例如，CHO细胞系)，其在Bax基因和Bak基因中的每一者中具有稳定整合的功能丧失突变或功能衰减突变。因此，本公开涉及方法、细胞和包含细胞的组合物，用于使用本公开的细胞生产目的产物，例如重组多核苷酸和/或重组多肽。特别地，本文所述的方法、细胞和组合物包括表达目的产物的改良哺乳动物细胞，其中该细胞(例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)在Bax基因和Bak基因中的每一者中具有稳定整合的功能丧失突变或功能衰减突变。细胞和细胞系中Bax基因和Bak基因的下调或缺失，减少了与不希望的细胞凋亡活性相关的不希望的影响，例如
真核细胞的降低的生存力和生产率。
[0008]在一方面，本专利技术提供了分离的真核细胞系，其中该细胞系在Bax基因和Bak基因中的每一者中包含稳定整合的功能丧失突变或功能衰减突变。
[0009]在某些实施例中，细胞系在Bax基因和Bak基因中的每一者中包含稳定整合的功能丧失突变。
[0010]在某些实施例中，细胞系包含在Bax基因和Bak基因中的每一者中的缺失。
[0011]在某些实施例中，细胞系是动物细胞系或真菌细胞系。细胞系可以是动物细胞系，例如哺乳动物细胞系。示例性哺乳动物细胞系包括杂交瘤细胞系、CHO细胞系、COS细胞系、VERO细胞系、HeLa细胞系、HEK 293细胞系、PER
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C6细胞系、K562细胞系、MOLT
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4细胞系、Ml细胞系、NS
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1细胞系、COS
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7细胞系、MDBK细胞系、MDCK细胞系、MRC
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5细胞系、WI
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38细胞系、WEHI细胞系、SP2/0细胞系、BHK细胞系(包括BHK
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21细胞系)或它们的衍生物。细胞系可以是CHO细胞系，例如CHO K1细胞系、CHO K1SV细胞系、DG44细胞系、DUKXB
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11细胞系、CHOK1S细胞系或CHO K1M细胞系，或它们的衍生物。细胞系可以是真菌细胞系，例如酵母细胞系。
[0012]在某些实施例中，细胞系进一步包含病毒基因组和编码病毒衣壳的一个或多个多核苷酸。
[0013]在某些实施例中，细胞系进一步包含编码目的产物的多核苷酸。
[0014]可以将编码目的产物的多核苷酸在靶向位置处整合在细胞系的细胞基因组中。可以将编码目的产物的多核苷酸随机整合在细胞系的细胞基因组中。编码目的产物的多核苷酸可以是染色体外多核苷酸。可以将编码目的产物的多核苷酸整合在细胞系的染色体中。
[0015]目的产物可以是或包含重组多肽。目的产物(例如重组多肽)可以是或包含抗体、抗体
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融合蛋白、抗原、酶或疫苗。目的产物可以是或包含抗体。目的产物可以是或包含抗原。目的产物可以是或包含酶。目的产物可以是或包含疫苗。
[0016]抗体可以是多特异性抗体或其抗原结合片段。抗体可以是多特异性抗体或其抗原结合片段。抗体可以包含单个重链序列和单个轻链序列或其抗原结合片段。抗体可以包括嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。抗体可以包括单克隆抗体。
[0017]在某些实施例中，细胞系比相应的分离的真核细胞系具有更高的比生产率，该分离的真核细胞系包含野生型Bax基因和Bak基因中的每一者中的多核苷酸和功能性拷贝。
[0018]在某些实施例中，与包含Bax基因和Bak基因中的每一者的功能拷贝的对应的分离的真核细胞系相比，该细胞系对细胞凋亡更具抗性。
[0019]在某些实施例中，细胞系用于细胞培养过程，例如分批进料、灌流、强化过程灌流、半连续灌流或连续灌流。例如但不限于，细胞系可用于强化灌流过程。
[0020]在另一方面，本公开提供了组合物，该组合物包含本专利技术的真核细胞系，例如第一方面的细胞系。该组合物还可以包含细胞培养基。
[0021]在某些实施例中，组合物用于细胞培养过程，例如分批进料、灌流、强化过程、半连续灌流或连续灌流。例如但不限于，细胞培养过程可以是强化灌流过程。
[0022]在另一方面，本公开提供了包含细胞培养基和多个真核细胞的细胞培养物，其中多个中的每个细胞包含在Bax基因和Bak基因中的每一者中的稳定整合的功能丧失突变或功能衰减突变。
[0023]在某些实施例中，细胞培养物用于细胞培养过程，例如分批进料、灌流、强化过程、
半连续灌流或连续灌流。细胞培养过程可以是强化灌流过程。
[0024]在某些实施例中，每个细胞在Bax基因和Bak基因中的每一者中包含稳定整合的功能丧失突变。
[0025]在某些实施例中，多个中的每个细胞包含在Bax基因和Bak基因中的每一者本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种分离的真核细胞系，其中所述细胞系包含在Bax基因和Bak基因中的每一者中的稳定整合的功能丧失突变或功能衰减突变。2.根据权利要求1所述的细胞系，其中所述细胞系包含在所述Bax基因和所述Bak基因中的每一者中的稳定整合的功能丧失突变。3.根据权利要求1或权利要求2所述的细胞系，其中所述细胞系为动物细胞系或真菌细胞系。4.根据权利要求3所述的细胞系，其中所述动物细胞系为哺乳动物细胞系。5.根据权利要求4所述的细胞系，其中所述哺乳动物细胞系为COS细胞系、VERO细胞系、HeLa细胞系、HEK 293细胞系、PER
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C6细胞系、K562细胞系、MOLT
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4细胞系、Ml细胞系、NS
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1细胞系、COS
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7细胞系、MDBK细胞系、MDCK细胞系、MRC
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5细胞系、WI
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38细胞系、WEHI细胞系、SP2/0细胞系、BHK细胞系或CHO细胞系，或它们的衍生物。6.根据权利要求5所述的细胞系，其中所述CHO细胞系为CHO K1细胞系、CHO K1SV细胞系、DG44细胞系、DUKXB
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11细胞系、CHOK1S细胞系或CHO K1M细胞系，或它们的衍生物。7.根据任一前述权利要求所述的细胞系，其中所述细胞系包含在所述Bax基因和所述Bak基因中的每一者中的缺失。8.根据任一前述权利要求所述的细胞系，其中所述细胞系进一步包含病毒基因组和编码病毒衣壳的一个或多个多核苷酸。9.根据任一前述权利要求所述的细胞系，其中所述细胞系进一步包含编码目的产物的多核苷酸。10.根据权利要求9所述的细胞系，其中将编码所述目的产物的所述多核苷酸在靶向位置处整合在所述细胞系的细胞基因组中。11.根据权利要求9所述的细胞系，其中将编码所述目的产物的所述多核苷酸随机整合在所述细胞系的细胞基因组中。12.根据权利要求9至11中任一项所述的细胞系，其中编码所述目的产物的所述多核苷酸为染色体外多核苷酸。13.根据权利要求9至11中任一项所述的细胞系，其中将编码所述目的产物的所述多核苷酸整合在所述细胞系的染色体中。14.根据权利要求9至11中任一项所述的细胞系，其中目的产物包括重组多肽。15.根据权利要求9至14中任一项所述的细胞系，其中所述目的产物包括抗体、抗体
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融合蛋白、抗原、酶或疫苗。16.根据权利要求15所述的细胞系，其中所述抗体为多特异性抗体或其抗原结合片段。17.根据权利要求15或权利要求16所述的细胞系，其中所述抗体包含单个重链序列和单个轻链序列或其抗原结合片段。18.根据权利要求15至17中任一项所述的细胞系，其中所述抗体包括嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。19.根据权利要求15至18中任一项所述的细胞系，其中所述抗体包括单克隆抗体。20.根据权利要求7至19中任一项所述的细胞系，其中与包含所述多核苷酸以及野生型Bax基因和Bak基因中的每一者的功能拷贝的对应的分离的真核细胞系相比，所述细胞系具有更高的比生产率。
21.根据任一前述权利要求所述的细胞系，其中与包含所述Bax基因和所述Bak基因中的每一者的功能拷贝的对应的分离的真核细胞系相比，所述细胞系对细胞凋亡更具抗性。22.根据任一前述权利要求所述的细胞系，其中所述细胞系被用于细胞培养过程，诸如分批进料、灌流、强化过程、半连续灌流或连续灌流。23.根据权利要求22所述的细胞系，其中所述细胞系被用于强化灌流过程。24.一种组合物，其包含根据任一前述权利要求所述的真核细胞系。25.根据权利要求24所述的组合物，其进一步包含细胞培养基。26.一种细胞培养物，其包含细胞培养基和多个真核细胞，其中所述多个中的每个细胞包含在Bax基因和Bak基因中的每一者中的稳定整合的功能丧失突变或功能衰减突变。27.根据权利要求26所述的细胞培养物，其中每个细胞包含在所述Bax基因和所述Bak基因中的每一者中的稳定整合的功能丧失突变。28.根据权利要求26或权利要求27所述的细胞培养物，其中所述多个中的每个细胞包含在所述Bax基因和所述Bak基因中的每一者中的缺失。29.根据权利要求26至28中任一项所述的细胞培养物，其中所述细胞为动物细胞或真菌细胞。30.根据权利要求29所述的细胞培养物，其中所述动物细胞为哺乳动物细胞。31.根据权利要求30所述的细胞培养物，其中所述哺乳动物细胞为COS细胞、VERO细胞、HeLa细胞、HEK 293细胞、PER
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C6细胞、K562细胞、MOLT
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4细胞、Ml细胞、NS
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1细胞、COS
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7细胞、MDBK细胞、MDCK细胞、MRC
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5细胞、WI
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38细胞、WEHI细胞、SP2/0细胞、BHK细胞或CHO细胞，或它们的衍生物。32.根据权利要求31所述的细胞培养物，其中所述CHO细胞为CHO K1细胞、CHO K1SV细胞、DG44细胞、DUKXB
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11细胞、CHOK1S细胞或CHO K1M细胞，或它们的衍生物。33.根据权利要求26至32中任一项所述的细胞培养物，其中所述细胞培养物进一步包含编码目的产物的多核苷酸。34.根据权利要求33所述的细胞培养物，其中将编码所述目的产物的所述多核苷酸在靶向位置处整合在所述细胞的细胞基因组中。35.根据权利要求33所述的细胞培养物，其中将编码所述目的产物的所述多核苷酸随机整合在所述细胞的细胞基因组中。36.根据权利要求33至35中任一项所述的细胞培养物，其中编码所述目的产物的所述多核苷酸为染色体外多核苷酸。37.根据权利要求33至35中任一项所述的细胞培养物，其中将编码所述目的产物的所述多核苷酸整合在所述细胞的染色体中。38.根据权利要求33至37中任一项所述的细胞培养物，其中所述目的产物包括重组多肽。39.根据权利要求33至38中任一项所述的细胞培养物，其中所述目的产物为抗体、抗体
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融合蛋白、抗原、酶或疫苗。40.根据权利要求39所述的细胞培养物，其中所述抗体为多特异性抗体或其抗原结合片段。41.根据权利要求39或权利要求40所述的细胞培养物，其中所述抗体包含单个重链序
列和单个轻链序列或其抗原结合片段。42.根据权利要求39至41中任一项所述的细胞培养物，其中所述抗体包括嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。43.根据权利要求39至42中任一项所述的细胞培养物，其中所述抗体包括单克隆抗体。44.根据权利要求26至43中任一项所述的细胞培养物，其中所述细胞中的每一个进一步包含重组多核苷酸。45.根据权利要求26至44所述的细胞培养物，其中所述细胞被用于细胞培养过程，诸如分批进料、灌流、强化过程、半连续灌流或连续灌流。46.根据权利要求45所述的细胞培养物，其中所述细胞被用于强化灌流过程。47.一种降低真核细胞中的细胞凋亡活性的方法，其包括向所述细胞施用基因工程系统，其中所述基因工程系统：a.敲低或敲除Bax多肽同种型的表达；以及b.敲低或敲除Bak多肽同种型的表达。48.根据权利要求47所述的方法，其中所述方法进一步包括将所述真核细胞用于分批进料、灌流、强化过程、半连续灌流或连续灌流细胞培养过程中。49.根据权利要求48所述的方法，其中所述真核细胞被用于强化细胞培养过程。50.根据权利要求47至49中任一项所述的方法，其中所述基因工程系统选自由以下项组成的组：CRISPR/Cas系统、锌指核酸酶(ZFN)系统、转录活化因子样效应子核酸酶(TALEN)系统及它们的组合。51.根据权利要求4...

【专利技术属性】
技术研发人员：S，
申请(专利权)人：基因泰克公司，
类型：发明
国别省市：