一种基于DNA纳米机器人的核酸标志物检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种基于DNA纳米机器人的核酸标志物检测方法及试剂盒，该检测方法使用表面经发夹DNA分子修饰的纳米粒子作为纳米机器人，捕获核酸标志物，然后在DNA聚合酶、引物、dNTP与待测样本混合孵育，实现纳米机器人的行走，以发夹DNA分子为模板产生dsDNA链，实现信号放大；再与CRISPR/Cas12a试剂混合进行活化孵育，然后加到修饰有DNA报告探针的电化学传感器上，所述双链修饰纳米粒子与CRISPR/Cas12a形成的复合物切割所述DNA报告探针；根据所述电化学传感器电信号的变化来判断待测样本中核酸标志物是否存在或计算核酸标志物的浓度。本发明专利技术的特异性强，检测灵敏度高，检测限宽，并且无需专业的荧光PCR设备和实验条件，方便快捷，成本低廉。成本低廉。成本低廉。

【技术实现步骤摘要】
一种基于DNA纳米机器人的核酸标志物检测方法及试剂盒


[0001]本专利技术属于生物医学检测
，涉及与疾病相关核酸检测，具体涉及一种基于DNA纳米机器人的核酸标志物检测方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]随着医学、生命科学的发展，对诸多疾病病理的研究越来越深入，疾病发展早期的一些标志物逐渐被发现，特别是与基因突变和蛋白表达过程相关的一些分子往往在病症之前出现。针对这些标志物分子，通过早期检测，能够实现在疾病初期的诊断、治疗，从而显著改善预后。例如，口腔鳞状细胞癌是一类高发病率的恶性肿瘤，极大影响了人类的健康。Hsa
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miRNA31
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5p(miRNA
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31)是早期口腔鳞状细胞癌的可靠标志物，在患者唾液中即可检出，但因其含量较低，在样本中准确检测微量的miRNA
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31成为了一个挑战。传统检测miRNA的方法主要为RNA印迹术(Northern blotting)、定量逆转录聚合酶链式反应(qRT
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PCR)等，但这些方法非常耗时，且引物设计繁琐，存在假阳性问题，并且需要昂贵的检测仪器，以及受过专业训练的专业检测人员进行操作。更便捷、准确性高、成本低廉的检测手段有待开发。

技术实现思路

[0003]有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种基于DNA纳米机器人的核酸标志物检测方法。
[0004]其技术方案如下：
[0005]一种基于DNA纳米机器人的核酸标志物检测方法，其关键在于，/>[0006]S1，提供一种靶向纳米粒子，该靶向纳米粒子由纳米粒子表面连接发夹DNA分子形成，该发夹DNA分子包括自折叠形成的茎区和环区，其中环区具有能够与核酸标志物通过碱基互补配对结合的序列，所述核酸标志物具有能够与所述环区结合的单链；
[0007]S2，将分散于缓冲液中的靶向纳米粒子、DNA聚合酶、引物、dNTP与待测样本混合孵育，待测样本中的核酸标志物与所述发夹DNA分子结合，在所述靶向纳米粒子表面行走，从而使所述发夹DNA分子以其自身为模板产生dsDNA链，实现信号放大，此时所述靶向纳米粒子转化为双链修饰纳米粒子；
[0008]S3，将步骤S2孵育后的液体或所述双链修饰纳米粒子与CRISPR/Cas12a试剂混合进行活化孵育，然后加到修饰有DNA报告探针的电化学传感器上，所述双链修饰纳米粒子与CRISPR/Cas12a形成的复合物切割所述DNA报告探针；
[0009]S4，根据所述电化学传感器电信号的变化来判断待测样本中核酸标志物是否存在，或与预先根据梯度标准试样建立的标准曲线对比，判断核酸标志物的浓度。
[0010]作为优选，上述纳米粒子为Fe3O4纳米粒子或金纳米粒子，所述纳米粒子表面经链霉亲和素修饰；
[0011]所述发夹DNA分子连接有生物素，所述发夹DNA分子通过生物素
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链霉亲和素相互
作用连接到所述纳米粒子上。
[0012]作为优选，上述步骤S2中，孵育温度为37℃，时间30min。
[0013]作为优选，上述电化学传感器包括金电极，所述金电极上预先修饰有DNA报告探针，所述双链修饰纳米粒子与CRISPR/Cas12a形成复合物并在金电极表面滚动，同时剪切所述DNA报告探针以释放出电化学分子，从而使金电极信号发生变化；
[0014]步骤S3中，将活化孵育后的液体滴加到金电极上。
[0015]作为优选，上述DNA报告探针包括发夹片段，该发夹片段的5
’
端标记有亚甲蓝，该发夹片段的3
’
端与所述金电极连接。
[0016]作为优选，步骤S4中，读取在电化学传感器上反应30min的电信号值进行判断和计算核酸标志物浓度。
[0017]本专利技术的目的之二在于提供一种试剂盒。
[0018]其技术方案如下：
[0019]一种试剂盒，其关键在于包括：链霉亲和素化的纳米粒子；
[0020]发夹DNA分子，包括自折叠形成的茎区和环区，其中环区具有能够与核酸标志物通过碱基互补配对结合的序列，该发夹DNA分子的3
’
端脱氧核苷酸连接有生物素，该发夹DNA分子与其互补序列形成的DNA双链具有能够被Cas12a蛋白识别的原间隔基序(PAM序列)；
[0021]引物，能够与所述发夹DNA下游特异性识别；
[0022]DNA聚合酶、RNA酶抑制剂、缓冲液；
[0023]CRISPR/Cas12a试剂，包括crRNA和Cas12a蛋白，其中crRNA具有与所述发夹DNA分子相对应的核苷酸片段；以及
[0024]固定有DNA报告探针的电化学传感器电极。
[0025]作为优选，上述链霉亲和素化的纳米粒子为表面修饰有链霉亲和素的Fe3O4纳米粒子或金纳米粒子。
[0026]作为优选，上述电化学传感器电极包括金电极，所述金电极上修饰有DNA报告探针，该DNA报告探针包括发夹片段，该发夹片段的5
’
端标记有亚甲蓝，该发夹片段的3
’
端与所述金电极表面连接。
[0027]作为优选，上述DNA报告探针的的碱基序列如SEQ NO.10所示。
[0028]作为优选，上述核酸标志物为Hsa
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miRNA31
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5p(miRNA
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31)，其碱基序列如SEQ NO.3所示；
[0029]所述发夹DNA分子的碱基序列如SEQ NO.1所示，所述引物的碱基序列如SEQ NO.2所示，所述crRNA的碱基序列如SEQ NO.4所示。
附图说明
[0030]图1为本专利技术的检测原理示意图；
[0031]图2为PAGE实验验证ISAR(invading stacking primer amplification reaction)和CRISPR/Cas12的反应可行性的PAGE电泳实验结果；
[0032]图3为链霉亲和素化的Fe3O4纳米粒子(A)、表面结合发夹DNA后(B)以及进行ISAR反应后(C)粒子表面电位变化；
[0033]图4为ISAR反应后双链修饰的Fe3O4纳米粒子与CRISPR/Cas12a形成的复合物具有
切割报告探针能力的验证实验结果；
[0034]图5为金电极电流信号随着检测反应体系反应时间的变化曲线；
[0035]图6为使用本专利技术的方法检测不同浓度miR
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31试样的结果，其中：(A)金电极电流信号与电压关系曲线；(B)金电极电流信号与核酸标志物浓度关系拟合曲线；
[0036]图7为用于检测口腔鳞状细胞癌标志物miR
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31的试剂盒特异性试验结果，其中：(A)添加不同核酸试样进行测试的金电极电流信号对比；(B)分别以标准缓冲液和唾液作为miR
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31溶剂制备的不同浓度核酸试样进行测试的金电极电流本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于DNA纳米机器人的核酸标志物检测方法，其特征在于：S1，提供一种靶向纳米粒子，该靶向纳米粒子由纳米粒子表面连接发夹DNA分子形成，该发夹DNA分子包括自折叠形成的茎区和环区，其中环区具有能够与核酸标志物通过碱基互补配对结合的序列，所述核酸标志物具有能够与所述环区结合的单链；S2，将分散于缓冲液中的靶向纳米粒子、DNA聚合酶、引物、dNTP与待测样本混合孵育，待测样本中的核酸标志物与所述发夹DNA分子结合，在所述靶向纳米粒子表面行走，从而使所述发夹DNA分子以其自身为模板产生dsDNA链，实现信号放大，此时所述靶向纳米粒子转化为双链修饰纳米粒子；S3，将步骤S2孵育后的液体或所述双链修饰纳米粒子与CRISPR/Cas12a试剂混合进行活化孵育，然后加到修饰有DNA报告探针的电化学传感器上，所述双链修饰纳米粒子与CRISPR/Cas12a形成的复合物切割所述DNA报告探针；S4，根据所述电化学传感器电信号的变化来判断待测样本中核酸标志物是否存在，或与预先根据梯度标准试样建立的标准曲线对比，判断核酸标志物的浓度。2.根据权利要求1所述的一种基于DNA纳米机器人的核酸标志物检测方法，其特征在于：所述纳米粒子为Fe3O4纳米粒子或金纳米粒子，所述纳米粒子表面经链霉亲和素修饰；所述发夹DNA分子连接有生物素，所述发夹DNA分子通过生物素
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链霉亲和素相互作用连接到所述纳米粒子上。3.根据权利要求1或2所述的一种基于DNA纳米机器人的核酸标志物检测方法，其特征在于：所述步骤S2中，孵育温度为37℃，时间30min。4.根据权利要求1或2所述的一种基于DNA纳米机器人的核酸标志物检测方法，其特征在于：所述电化学传感器包括金电极，所述金电极上预先修饰有DNA报告探针，所述双链修饰纳米粒子与CRISPR/Cas12a形成复合物并在金电极表面滚动，同时剪切所述DNA报告探针以释放出电化学分子，从而使金电极信号发生变化；步骤S3中，将活化孵育后的液体滴加到金电极上。5...

【专利技术属性】
技术研发人员：伍煜，田刚，刘靳波，
申请(专利权)人：西南医科大学附属医院，
类型：发明
国别省市：