一种过表达ALK4基因的稳转细胞株的构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种过表达ALK4基因的稳转细胞株的构建方法及其应用，包括：构建高滴度的ALK4过表达慢病毒，感染目的细胞株，通过在传代过程中采用中浓度的嘌呤霉素对转染后的细胞株进行两次悬浮筛选，获得高效、稳定的ALK4过表达稳转细胞株。相对于传统的稳转细胞株构建方法，本发明专利技术提供的构建方法通过两次悬浮筛选将筛选时间缩短至4天，且不需要低浓度嘌呤霉素进行后续维持培养，克服了筛选步骤繁琐，时间成本高的难题，并可实现100%的转染效率。本发明专利技术的方法应用于高效、稳定的ALK4过表达稳转细胞株的构建，为深入探究ALK4的作用机制提供一种可靠的研究基础。制提供一种可靠的研究基础。

【技术实现步骤摘要】
一种过表达ALK4基因的稳转细胞株的构建方法及其应用


[0001]本专利技术涉及生物技术基因工程领域，具体而言，涉及ALK4基因过表达稳转细胞株及其构建方法。

技术介绍

[0002]活化素受体样激酶4（activin receptor
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like kinase 4，ALK4）是位于细胞膜上的一类Ⅰ型活化素受体，隶属TGF
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β受体超家族，在组织中广泛表达，是参与调控机体生理及病理过程的关键因子。ALK4的功能涉及胚胎发育、神经系统分化、生殖细胞发育、肿瘤形成及免疫抑制等，其作用主要通过磷酸化Smad2/3信号通路分子C端的丝氨酸残基，除外Smad2/3信号通路还可通过MAPKs、Akt/PI3K、Wnt/β
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catenin等，从而调控相关基因的表达。ALK4的作用广泛，研究意义大，有着极大的市场应用场景。
[0003]研究特定基因的功能最常用的手段是在宿主细胞中持续稳定过表达或者沉默该基因，筛选稳定细胞株；与瞬时转染相比，稳转细胞株便于长期观察基因对于细胞功能的影响，因此稳转细胞株是开展基因功能研究、靶点验证及药物筛选的重要工具。
[0004]稳转细胞株的构建一般分为脂质体转染法和病毒转染法，脂质体转染周期长且效率低；应用慢病毒转染筛选稳定细胞株有更高的效率，且适用于大部分难转染的细胞，是构建稳定细胞株的理想方法。但传统的利用慢病毒转染法构建稳转株是一个复杂的过程，首先需要通过预实验摸索合适的慢病毒MOI值（病毒感染复数），从而确定筛选药物剂量；再进行慢病毒感染细胞，感染72h后加入预实验确定的筛选药物剂量进行筛选，每天或隔天更换新鲜的含药培养基，药物筛选至少持续14天，在之后的培养过程中需继续使用含一半药物剂量或低药物剂量的培养基进行培养，以防止插入基因的丢失，保证稳转细胞株的转染效率。
[0005]由于转染的细胞株不同，感染病毒最适MOI值不同，构建新的稳转细胞株均需进行繁琐漫长的预实验步骤，在后续的培养过程中还需长期持续加入药物来维持，增加细胞污染的风险。此外，稳转细胞株筛选，一般为多克隆或混克隆筛选，荧光强度通常强弱夹杂，很难使转染率达到100% ，这无疑为稳转细胞株的构建带来更大的困难。

技术实现思路

[0006]为实现上述专利技术目的，本申请的技术方案如下：一种过表达ALK4基因的稳转细胞株的构建方法，构建步骤如下：1) 构建慢病毒载体：将ALK4基因插入过表达慢病毒载体质粒中，转化感受态，获得阳性质粒，即ALK4基因过表达慢病毒载体质粒；2) 慢病毒包装：将所述ALK4基因过表达慢病毒载体质粒与病毒包装辅助质粒共转染细胞，获得ALK4基因重组慢病毒；3）细胞转染及悬浮筛选：将所述ALK基因重组慢病毒转染目的细胞株，消化并重悬转染后的细胞，于培养基中加入4
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6μg/mL嘌呤霉素对细胞进行至少一次悬浮筛选，得到高
效稳定的ALK4基因过表达稳转细胞株。
[0007]进一步地，上述步骤3）中细胞转染72h后消化细胞，用新鲜的培养基重悬细胞并接种至新的培养皿中，接种的同时于培养基中加入5μg/mL嘌呤霉素进行第一次筛选，12h后进行换液，待细胞长满后，再次消化细胞，用新鲜的培养基重悬细胞后接种至新的培养皿中，再次加入5μg/mL嘌呤霉素进行第二次筛选，12h后更换为正常细胞培养液，换液后于荧光显微镜下观察转染效果，稳转细胞株转染率达到100％。
[0008]进一步地，上述步骤1）和步骤2）中所述的过表达慢病毒骨架载体质粒为pLVX
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mcmv
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Zsgreen1
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Puro、病毒包装辅助质粒为psPAX2、病毒包装辅助质粒为pMD2.G，上述三质粒共同组成慢病毒包装系统。
[0009]进一步地，上述步骤2）中所述获得的ALK4基因重组慢病毒的病毒滴度不小于108TU/mL。
[0010]进一步地，上述步骤3）中ALK基因重组慢病毒转染目的细胞株的过程中，以Lipofectamine 2000作为转染试剂，以MOI为100进行转染，并加入终浓度为5μg/mL的Polybrene，以提高转染效率。
[0011]另外，本专利技术还提供了按照所述的一种过表达ALK4基因的稳转细胞株的构建方法在构建ALK4过表达型稳转细胞株的应用。
[0012]相对于现有技术，本专利技术具有如下有益效果：（1）革新了稳转株筛选方法，减少筛选流程，缩短筛选周期并提高了转染效率：现有技术稳转细胞株筛选过程至少持续14天，之后还需要维持培养1个月，本专利技术对转染后的细胞株进行两次悬浮筛选，将筛选周期缩短至4天，且不需要低浓度嘌呤霉素进行后续维持培养，大大减少了稳转株筛选周期，实现了高效、稳定的过表达ALK4稳转细胞株的构建，转染率可达100%。
[0013]（2）优化了嘌呤霉素使用浓度，提高了筛选成功率和稳定性：使用中浓度嘌呤霉素（4
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6μg/mL）进行两次悬浮筛选，获得的稳转细胞株与空白组对比，mRNA和蛋白水平差异具有显著性，持续培养一个月后稳转细胞株在mRNA和蛋白水平差异依旧十分明显，筛选后不再使用低浓度的嘌呤霉素维持也不会影响稳转细胞株的性状，说明构建了高效、稳定的稳转细胞株。
[0014]（3）优化了转染步骤，提高了转染效率：选择高滴度的病毒进行转染，以Lipofectamine 2000作为转染试剂，以MOI为100进行转染，并加入终浓度为5μg/mL的Polybrene，大大提高了转染效率。
[0015]（4）将本专利技术应用于高效、稳定的ALK4过表达稳转细胞株的构建，为深入探究ALK4的作用机制提供一种可靠的研究基础。
[0016]显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0017]以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。
[0018]附图说明
[0019]图1为病毒包装辅助质粒（psPAX2）的质粒图谱。
[0020]图2为病毒包装辅助质粒（pMD2.G）的质粒图谱。
[0021]图3为过表达慢病毒骨架载体质粒（pLVX
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mcmv
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Puro）的质粒图谱。
[0022]图4为ALK4过表达稳转细胞株的荧光显微镜观察结果；其中，图 A为传统筛选方法筛选后的各稳转细胞株荧光显微镜观察图片；图B为本专利技术筛选方法筛选后的各稳转细胞株荧光显微镜观察图片；U87
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Con：人胶质瘤细胞株（U87）空白细胞对照组；H1299
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Con：人肺癌细胞株（H1299）空白细胞对照组；U87
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Oe：人胶质本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种过表达ALK4基因的稳转细胞株的构建方法，其特征在于：构建步骤如下：1)构建慢病毒载体：将ALK4基因插入过表达慢病毒载体质粒中，转化感受态，获得阳性质粒，即ALK4基因过表达慢病毒载体质粒；2)慢病毒包装：将所述ALK4基因过表达慢病毒载体质粒与病毒包装辅助质粒共转染细胞，获得ALK4基因重组慢病毒；3）细胞转染及悬浮筛选：将所述ALK基因重组慢病毒转染目的细胞株，消化并重悬转染后的细胞，于培养基中加入4
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6μg/mL嘌呤霉素对细胞进行至少一次悬浮筛选，得到高效稳定的ALK4基因过表达稳转细胞株。2.根据权利要求1或2所述的一种过表达ALK4基因的稳转细胞株的构建方法，其特征在于，步骤3）中细胞转染72h后消化细胞，用新鲜的培养基重悬细胞并接种至新的培养皿中，接种的同时于培养基中加入5μg/mL嘌呤霉素进行第一次筛选，12h后进行换液，待细胞长满后，再次消化细胞，用新鲜的培养基重悬细胞后接种至新的培养皿中，再次加入5μg/mL嘌呤霉素进行第二次筛选，12h后更换为正常细胞培养液，换液后于荧光显微镜下观察转染效...

【专利技术属性】
技术研发人员：周勇，苏晶晶，
申请(专利权)人：重庆威斯腾生物医药科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：