本发明专利技术公开了一种仅具有RNA靶切割活性的原核Argonaute蛋白质在RNA编辑中的应用，所述Argonaute蛋白质来源于中温原核生物Verrucomicrobia bacterium，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示或为与SEQ ID NO:1相似度极高且具有相同功能的蛋白质；该蛋白质对单链向导DNA具有结合活性，并且仅仅只对与单链向导DNA互补配对的RNA靶具有核酸酶活性，故可利用该蛋白质进行体内外靶向RNA编辑，为RNA编辑提供了一个全新的有力工具。供了一个全新的有力工具。供了一个全新的有力工具。
【技术实现步骤摘要】
一种仅具有RNA靶切割活性的原核Argonaute蛋白质在RNA编辑中的应用
[0001]本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种原核生物来源的仅具有RNA靶切割活性的原核Argonaute蛋白质在体内或体外的RNA编辑中的应用。
技术介绍
[0002]目前，真核生物来源的Argonaute蛋白质(简称eAgos)能够在常温条件下催化RNA向导(gRNA)引导的RNA切割反应，并在RNA干扰(RNA interference，RNAi)途径中发挥至关重要的作用。原核生物来源的Argonaute蛋白质(简称pAgos)相比eAgos功能和结构更加多样化，但其生理功能长期以来难以捉摸。早期研究主要集中于高温生物来源的pAgos，除了Marinitogapiezophila来源的MpAgo偏爱利用5
’
末端羟基化(5
’
OH)的向导RNA(gRNA)切割靶单链DNA(single
‑
stranded DNA，ssDNA)和RNA靶之外，其余高温来源的pAgos都偏爱利用5
’
末端磷酸化(5
’
P)的向导DNA(gDNA)切割ssDNA靶和/或RNA靶。然而高温生物来源的pAgos在中温条件下都只有低水平的gDNA引导的ssDNA靶和/或RNA靶切割活性，这限制了基于pAgos的基因编辑和RNA编辑技术的应用开发。最近的研究聚焦于中温生物来源的pAgos，以期找到能够在中温条件下有效切割DNA靶和/或RNA靶的pAgos。然而，几乎所有已经表征的中温pAgos都偏爱在中温下在gDNA的引导下切割DNA靶，鲜有报道能够有效切割RNA靶的pAgos。嗜盐古菌Natronobacteriumgregory来源的NgAgo可以在常温下在gDNA的引导下切割RNA靶，但它的切割位点尚不确定，且并未证明能切割具有高级结构的RNA。中温细菌Kurthiamassiliensis来源的KmAgo可以在gDNA和gRNA引导下切割DNA靶和RNA靶，但更加偏爱切割DNA靶。耐冷细菌Mucilaginibacterpaludis来源的MbpAgo偏爱在gDNA引导下切割RNA靶，但仍保留有切割DNA靶的活性。迄今为止，还未报道能专一性切割RNA靶的pAgos。
[0003]长期以来，人们广泛关注靶向RNA的可编程核酸内切酶，因为这类酶可以应用于RNA结构功能研究、核酸检测领域、RNA纳米技术和RNA治疗等领域。目前使用的方法都存在一定的局限性。成簇的规律间隔的短回文重复序列相关系统(CRISPR
‑
Cas)是目前用于可编程核酸切割的最广泛的酶工具，新近发现的CRISPR
‑
Cas13核酸酶正迅速应用到多个领域，包括RNA编辑、病毒清除、核酸检测。但CRISPR
‑
Cas核酸酶需要gRNA向导，而RNA主要通过体外转录和纯化制备，或者通过化学合成，成本较高；此外，该类核酸酶尚未显示出识别结构化的RNA元件的功能。有的eAgos也能够在gDNA的引导下在中温切割几乎所有类型的RNA，但大多数动植物细胞内存在RNAi途径，这些eAgos可能会干扰细胞本身的RNAi功能，这阻碍了将eAgos应用于细胞内的RNA编辑。而原核生物体内不存在RNAi途径，因此pAgos可能不会影响细胞本身的RNAi功能。因此，RNA编辑领域仍然存在对能在常温条件下发挥作用并能应用于动植物细胞的RNA编辑的pAgos的迫切需求。
[0004]RNA编辑是指在mRNA水平上改变遗传信息的过程，RNA编辑与生物细胞发育和分化有关，是基因表达调控的一种重要方式。然而，基于上述陈述可知现有的RNA编辑技术仍存在以下问题及缺陷：
①
现有pAgos蛋白质虽然能在常温条件下有效靶向切割各类RNA并能应
用于动植物细胞的RNA编辑的，但它们也展示出切割DNA的活性，这可能对细胞内DNA造成损伤；
②
通用的RNAi技术需要使用双链RNA(dsRNA)，化学合成dsRNA价格高、定制周期长，体外转录dsRNA价格相对低廉但操作步骤繁琐、耗时；
③
shRNA表达质粒方式基因干扰效果持久、经济，但制备耗时、存在非特异性基因抑制等；
④
基于CRISPR的技术也需要用到长的gRNA，存在和RNAi技术一样的问题，此外CRISPR相关蛋白质(如Cas13a)依赖于靶位点附近的特殊基序来识别并结合靶，这限制了可以编辑的范围，并且CRISPR相关蛋白质还存在极强的非特异性“附带切割”活性，这令人担忧其可能的脱靶反应。
技术实现思路
[0005]针对现有技术中的问题，本专利技术的目的在于提供一种操作简单、价格低廉、高效且专一切割RNA靶的技术。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术的技术方案具体如下：
[0007]本专利技术发现了来源于中温原核生物Verrucomicrobia bacterium的Argonaute蛋白质，命名为VbAgo，其对单链向导DNA具有结合活性，并且仅仅只对与单链gDNA互补配对的RNA靶具有核酸酶活性，故其能够对RNA靶进行特异性切割；上述VbAgo的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，且编码VbAgo的基因序列如SEQ ID NO:2所示。
[0008]对VbAgo的氨基酸序列的第181
‑
306，和/或386
‑
548,和/或549
‑
782位点中进行一个或多个氨基酸的替换和/或删除，仍有望获得具有与VbAgo相同功能的VbAgo突变体蛋白。
[0009]上述位点为VbAgo催化活性的关键位点，通过对VbAgo蛋白质的催化活性必不可少的一个或多个氨基酸残基可以形成新的核酸酶活性，有可能增加或减小其核酸内切酶活性，但也有可能会导致核酸内切酶活性的缺失。缺失核酸内切酶活性的突变体仍具有对ssDNA向导的结合活性，可拓宽其应用。
[0010]在上述技术方案中，能被VbAgo及VbAgo突变体蛋白特异性切割的RNA靶可以为有高级结构的RNA靶，也可以为没有高级结构的RNA靶；具体的，RNA靶可以为体外转录的RNA，可以为病毒基因组RNA，可以为mRNA，或为细胞内其他种类的RNA。
[0011]本专利技术进一步提供了使用上述专一切割RNA靶的VbAgo或VbAgo突变体蛋白在体内外进行RNA编辑的方法，具体为：将Argonaute蛋白质、gDNA和靶RNA加入反应体系中进行特异性切割反应。
[0012]优选地，gDNA为5
’
末端磷酸化的ssDNA或5
’
末端羟基化的ssDNA；更加优选地，gDNA的5
’
末端为磷酸化时，复合物对RNA靶的核酸酶活性更高。
[0013]优选地，gDNA的长度为13至35个核苷酸。更加优选地，gDNA的长度为15至20个核苷酸。
[0014]优选地，所述反应体系包本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种原核Argonaute蛋白质在体内或体外RNA编辑中的应用，其特征在于，所述Argonaute蛋白质仅具有RNA靶切割活性，所述Argonaute蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；或者为在SEQ ID NO:1所示序列的第181
‑
306、或/和386
‑
548、或/和549
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782位点中存在一个或多个氨基酸残基的替换和/或删除，且具有与SEQ ID NO:1所示蛋白质相同功能的蛋白质。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述RNA靶为没有高级结构的RNA，或为有高级结构的RNA。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，编码SEQ ID NO:1所示蛋白质的基因的序列如SEQ ID NO:2所示。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在反应体系...
【专利技术属性】
技术研发人员：马立新，刘琦，刘洋，王飞，陈晚苹，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：
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