角蛋白酶及其与杜仲叶提取物、胆汁酸的复配酶制剂和在制备动物养殖饲料中的应用制造技术

本发明专利技术提供了角蛋白酶及其与杜仲叶提取物、胆汁酸的复配酶制剂和在制备动物养殖饲料中的应用。本发明专利技术通过筛选得到角蛋白酶KM8和KM9，所述突变体的突变位点依次为：Y161M/V199A和Y161M/K78R。本发明专利技术的突变体KM7、KM8和KM9在75℃水浴5分钟后，酶活残留率由20%分别提升至60%、70%，热稳定性效果提升明显。并且，本发明专利技术将突变体与杜仲叶提取物和胆汁酸复配得到的酶制剂，能够降低动物饲料中的粗蛋白，提高蛋白质的利用率，降低养殖成本。降低养殖成本。降低养殖成本。

【技术实现步骤摘要】
角蛋白酶及其与杜仲叶提取物、胆汁酸的复配酶制剂和在制备动物养殖饲料中的应用


[0001]本专利技术属于基因工程和酶工程领域，具体涉及角蛋白酶及其与杜仲叶提取物、胆汁酸的复配酶制剂和在制备动物养殖饲料中的应用。

技术介绍

[0002]角蛋白酶是一种能够降解角蛋白类底物(例如角质，皮屑，羽毛等)的特异性角蛋白酶，由真菌、放线菌和细菌等多种微生物以角蛋白为单一碳源生长时产生。角蛋白中粗蛋白含量在80％以上，各种氨基酸总量在70％以上，动物必需氨基酸种类齐全，同时含有较多大量元素、微量元素和未知生长因子，是一种良好的、可替代或部分替代鱼粉的饲料蛋白来源，以及肥料来源，对它的开发利用具有重要的应用前景。
[0003]目前，国内角蛋白酶研究较多仍处于菌株的筛选、分离和角蛋白酶分离与纯化以及酶学性质的阶段。但角蛋白酶在较高温度下热稳定性较差，在75℃保温5分钟后，残余酶活仅为20%，限制了该酶的工业化生产和产品开发，尤其在饲料酶加工等领域通常涉及到较高温操作，导致酶容易失活。因此，提升角蛋白酶的热稳定性将进一步促进该酶在工业生化产中的应用和推广。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供了一种角蛋白酶及其与杜仲叶提取物、胆汁酸的复配酶制剂和在制备动物养殖饲料中的应用。本专利技术筛选得到热稳定性提高的突变体：KM7、KM8、KM9，并将KM9与杜仲叶提取物和胆汁酸混合，制得的复配酶制剂具有提高蛋白质利用率的作用。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：本专利技术提供了一种热稳定性提高的角蛋白酶，所述角蛋白酶为氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示的KM8或者氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的KM9。
[0006]进一步的，所述角蛋白酶KM8是由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的角蛋白酶的第161位的酪氨酸变为甲硫氨酸和第199位缬氨酸变为丙氨酸获得的；所述角蛋白酶KM9是由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的角蛋白酶的第161位的酪氨酸变为甲硫氨酸和第78位的赖氨酸变为精氨酸获得的。
[0007]本专利技术还提供了一种编码基因，其编码所述的角蛋白酶。
[0008]进一步的，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示或者核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。
[0009]本专利技术还提供了包含所述编码基因的基因工程菌，所述基因工程菌为枯草芽胞杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌或地衣芽胞杆菌。
[0010]本专利技术还提供了一种复配酶制剂，所述复配酶制剂中包含权利要求1所述的角蛋白酶、杜仲叶提取物和胆汁酸。
[0011]进一步的，在所述复配酶制剂中，角蛋白酶、杜仲叶提取物和胆汁酸的体积比为3:
1:2。
[0012]进一步的，所述角蛋白酶具体为角蛋白酶KM9，其酶活不低于300 U/mL。
[0013]本专利技术还提供了所述的复配酶制剂在制备动物养殖饲料中的应用。
[0014]进一步的，所述复配酶制剂的用量为300 g/t
‑
500 g/t动物日粮。
[0015]与现有技术相比，本专利技术的优点和技术效果是：本专利技术以Bacillus licheniformis来源的角蛋白酶基因为基础，经过随机突变，构建突变体文库和高通量定向筛选的方法，得到了包含Y161M的单点突变体KM7，分别包含Y161M/V199A、Y161M/K78R的双位点突变体KM8和KM9。本专利技术改造后的突变体KM7，KM8和KM9相比于原始角蛋白酶，突变体经过75℃处理5分钟后，酶活残留率由20%分别提升至55%、60%、50%，热稳定性效果提升明显，为其产业化应用及产品推广奠定基础。并且，本专利技术将突变体与杜仲叶提取物和胆汁酸复配得到的酶制剂，能够降低动物饲料中的粗蛋白，提高蛋白质的利用率，降低养殖成本。
附图说明
[0016]图1是角蛋白酶基因重组质粒构建图。
[0017]图2是角蛋白酶突变体筛选过程图。
[0018]图3是角蛋白酶突变体75℃处理5分钟，酶活残留率。
[0019]图4是角蛋白酶突变体KM9在15L发酵罐中的发酵数据。
具体实施方式
[0020]为了便于理解本专利技术，以下将结合附图及实施例对本文专利技术做更全面、详细地说明，但本专利技术的保护范围并不限于以下具体实施例。
[0021]以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，可以参照《分子克隆实验指南》(第三版)J .萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。具体实施例中使用的试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。
[0022]在本专利技术中，LB培养基配方为：1％胰蛋白胨，0 .5％酵母提取物，1％NaCl。发酵培养基配方为：豆粕3.5
‑
10%、棉籽粕5
‑
10%、玉米粉2
‑
6%、PPG
‑
20000 0.5
‑
1.0%、蛋白酶0.5
‑
1.0%、淀粉酶0.5
‑
1.0%、磷酸氢二钠0.2
‑
0.5%，以质量比计。
[0023]在本专利技术中，酶活力测定参照《GBT 23527
‑
2009 蛋白酶制剂》中蛋白酶的测定方法。
[0024]实施例1：角蛋白酶基因重组菌构建及其突变体文库构建参考Bacillus licheniformis来源的角蛋白酶氨基酸序列(SEQ ID NO：1)和DNA序列(SEQ ID NO：2)设计引物，在5
’
端设计Kpn I限制性酶切位点，3
’
端设计BamH I限制性酶切位点。进行PCR扩增目的条带：使用引物如下，KF: CGGGGTACCATGATGAGGAAAAAGAGTTT（SEQ ID NO：9）；KR: CGCCCATCCTTATTGAGCGGCAGCTTCGA（SEQ ID NO：10）。
[0025]反应体系为：PCR上游引物（25pmol/
µ
L）1
µ
LPCR下游引物（25pmol/
µ
L）1
µ
L
ꢀ
dNTP混合液4
µ
L PCRBuffer5
µ
L模板DNA1
µ
LDNA聚合酶0.5
µ
L加双蒸水至总体积50
µ
L反应条件为：95℃预变性3min，94℃变性10sec，58℃退火30sec，72℃延伸1min，循环30次，72℃，后延伸10min，15℃保存。
[0026]将PCR产物进行电泳，将条带单一的PCR产物进行纯化，双酶切，与pWB980载体进行连接（按照试剂盒说明步骤进行），并转化枯草芽胞杆菌WB600，涂布含有抗生素的平板，筛选重组菌。
[0027]突变体文库构建，用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒，以S本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种角蛋白酶，其特征在于，所述角蛋白酶为氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示的KM8或者氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的KM9。2.根据权利要求1所述的角蛋白酶，其特征在于，所述角蛋白酶KM8是由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的角蛋白酶的第161位的酪氨酸变为甲硫氨酸和第199位缬氨酸变为丙氨酸获得的；所述角蛋白酶KM9是由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的角蛋白酶的第161位的酪氨酸变为甲硫氨酸和第78位的赖氨酸变为精氨酸获得的。3.一种编码基因，其特征在于，其编码权利要求1所述的角蛋白酶。4.根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示或者核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。5.包含权利要求3所述编...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹爱智，娄倩倩，张西雷，
申请(专利权)人：山东龙昌动物保健品有限公司，
类型：发明
国别省市：