一种IL-17A和阿霉素联合诱导制备体外足细胞激素抵抗损伤模型的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种IL

【技术实现步骤摘要】
一种IL
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17A和阿霉素联合诱导制备体外足细胞激素抵抗损伤模型的方法及其应用

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[0001]本专利技术涉及一种IL
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17A和阿霉素联合诱导制备体外足细胞激素抵抗损伤模型的方法及其应用，涉及筛选具有改善激素抵抗型肾病综合征潜力药物的


技术介绍
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[0002]2020年2月13日Lancet报道：在2017年，全球慢性肾脏疾病(CKD)病例数为6.97亿人(9.1％)，其中有120万人直接死于CKD；肾功能损害可导致140万心血管疾病相关患者死亡，CKD被列为第十二大死亡原因。肾病综合征(NS)是一组以大量蛋白尿、水肿、高脂血症和低白蛋白血症为基本特征的临床症候群，是肾内科常见的CKD。糖皮质激素(GCs)类药物是目前临床治疗NS的首选药物，但是研究表明在NS患者中儿童约有20％，成人约有50％对激素治疗反应性差，会发展为激素抵抗型肾病综合征(SRNS)。对于SRNS患者，尽管可使用免疫抑制剂进行治疗，但疗效非常不理想，约有36％～50％的SRNS患者在10年内会发展为终末期肾衰竭(ESRD)，严重威胁患者的生命健康。
[0003]目前对SRNS患者，临床可供选择的治疗方案有：大剂量激素冲击疗法、细胞毒或新型免疫抑制剂或生物制剂(如环磷酰胺、环孢素A、他克莫司、霉酚酸酯、利妥昔单抗等)单药或联合激素疗法。虽然上述多种SRNS治疗方案均能取得一定的临床疗效，但这些方案的疗效仍然有限或存在复发性。长期应用激素会导致感染、高血压、骨质疏松、白内障等副作用，新的免疫抑制剂也会带来更多、更严重的毒副反应，如严重肝肾功能损害、严重感染、糖尿病、血液学和胃肠道毒性等。因此急需开发可以降低现有药物的不良反应并且对SRNS治疗的药物。
[0004]GCs主要通过与糖皮质激素受体(GR)结合来发挥药理活性。GR是配体依赖性转录活化因子，属于核受体超家族中的一员，由NR3C1基因编码。GR由选择性剪切或者选择性翻译起始位点产生不同的亚型，主要包括GRα、GRβ、GRγ、GR
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A和GR
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P。GRα和GRβ是最主要的亚型，GRα能够与GCs结合，调节基因的表达，发挥GCs药理活性。GRβ可以调节很多对GRα调节不敏感的基因的表达，另外，GRβ能够减弱GRα的转录活性，起到拮抗GRα的作用，导致激素抵抗。因此，GRα的作用受GRα、GRβ数量以及二者比例的影响，当GRα的表达量降低或者GRβ的表达量上升，导致GRα/GRβ的比例下降时，GCs的生物学效应产生影响，导致机体对GCs作用产生抵抗。
[0005]由于SRNS的发病机制较为复杂、病程较长，因此对于SRNS模型的复制是目前较为棘手的问题，尚无成熟的造模方法，这无疑给药物的研发造成了阻碍。足细胞是一种位于肾小球基底膜的外层的终末期分化肾上皮细胞，在维持肾小球滤过屏障完整性和肾小球正常滤过功能方面发挥重要作用。足细胞的再生能力非常有限并对于细胞压力较为敏感，极易受到损伤。足细胞损伤后其迁移能力异常增加，会从肾小球基底膜脱落，导致肾小球滤过屏障受损，产成蛋白尿，是NS及SRNS等慢性肾病发生发展的关键机制。因此，保护足细胞结构的完整性及减少足细胞的损伤是NS及SRNS治疗的重要策略。

技术实现思路
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[0006]在生物制药研究的过程中，如果将某种药物应用于相应疾病的动物模型时具有良好的治疗效果时，将仍会进行一系列体外实验，深入探讨药物的作用机制。于是随着生物技术的发展，细胞实验在药物作用机制研究上有越来越重要的作用。而且研究人员在筛选药物活性物时一般会先进行体外细胞实验，即选用相应的细胞株进行实验，模拟病理状态下的细胞环境，评价药物的作用效果，药物在相应的细胞实验中有效果时再进行动物实验，从而达到可以节约资源、成本，并且符合动物实验伦理福利等目的。
[0007]寻找治疗或者缓解患者激素抵抗及耐受成为研究热点，然而，动物模型前的细胞筛选模型并未建立。为解决现有技术中存在的问题寻找一种能够有效建立激素抵抗模型的方法，本专利技术提供一种建立体外足细胞激素抵抗模型的方法，并通过此模型初步筛选了对激素抵抗的足细胞损伤有保护作用的人参皂苷。
[0008]为实现上述目的，本专利技术提供的技术方案如下：
[0009]一种IL
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17A和ADR联合诱导的体外激素抵抗模型的制备方法以及应用。选用人肾足细胞为代表研究对象，用终浓度为100ng/mL的IL
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17A和0.5μmol/L ADR联合刺激正常培养的肾足细胞，并选用糖皮质激素类药物(GCs)地塞米松(DEX)为阳性对照药。
[0010]DEX组足细胞中GR及足细胞标志蛋白Nephrin的表达水平明显升高，IL
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17A和ADR联合可以抑制DEX诱导足细胞GR及Nephrin蛋白的表达水平。qRT
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PCR实验结果表明，DEX组足细胞GR mRNA的表达水平显著升高，IL
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17A和ADR联合可以降低足细胞中GR mRNA的表达水平。ELISA实验结果显示IL
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17A和ADR联合可以减弱DEX与GR的结合活性，从而影响DEX发挥药理作用。IL
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17A和ADR可以在降低GRα表达水平的同时升高GRβ的表达水平，从而降低GRα/GRβ的比值，导致足细胞产生激素抵抗。
[0011]GCs与GR结合后，促使GR易位至细胞核发挥转录活性，包括反式激活和反式抑制。其中GR通过反式抑制结合其他转录因子(如NF
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κB)，进而抑制其下游基因(IL
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6、IL
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8、TNF
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α)的表达，发挥抗炎的作用；而GCs大多数的不良反应是由GR的反式激活引起的。IL
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17A和ADR可以升高足细胞中NF
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κB P65 mRNA的表达水平，减弱GR的反式抑制作用，并对DEX诱导的GR反式激活有促进作用。由此说明，IL
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17A和ADR不仅可以引起激素抵抗，还会减弱GC的反式抑制作用，增强GCs的不良反应。
[0012]所述方法选用的肾足细胞，包括人肾足细胞和其他种属的肾足细胞及其他细胞，优选是人肾足细胞。所述方法制备的模型用于筛选具有改善激素抵抗型肾病综合征的药物及其他治疗激素抵抗型疾病的药物。本专利技术通过模型检测原人参二醇、人参皂苷CK和原人参三醇对足细胞激素抵抗损伤模型的保护作用。所述模型检测中使用的剂量相同，所述剂量是原人参二醇、人参皂苷CK和原人参三醇的剂量为10～40μmol/L，优选剂量为20μmol/L。
[0013]模型检测同一剂量的原人参二醇、人参皂苷CK和原人参三醇对足细胞激素抵抗损伤模型的保护作用，结果显示原人参二醇缓解激素抵抗的足细胞损伤的作用效果较佳。
[0014]基于激素抵抗模型建立成功的基础上，进一步筛选具有改善激素抵抗潜力的人参皂苷，为将其开发为治疗激素抵抗型本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肾足细胞激素抵抗损伤模型的制备方法，其特征在于所述制备方法通过使用IL
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17A和阿霉素联合刺激肾足细胞，建立肾足细胞激素抵抗损伤模型。2.根据权利要求1所述肾足细胞激素抵抗损伤模型的制备方法，其特征在于方法是通过加入100ng/mL的IL
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17A和0.5μmol/L的阿霉素联合刺激正常培养的肾足细胞，并通过Western Blot和qRT
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PCR等方法检测细胞GR、GRα、GRβ及Nephrin的蛋白及mRNA表达情况及利用ELISA法检测GR
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DNA的结合活性，并通过荧光素酶报告基因法进一步检测了GR的反式激活及反式抑制，验证模型建立成功。3.根据权利要求1或2任一所述的模型制备方法，其特征在于方法选用的肾足细胞，包括人肾足细胞和其他种属的肾足细胞及其他细胞。4.根据权利要求3所述的模型制备方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：范华英，王梦影，李新，刘珂，宋泽宇，谢则平，甘海林，李振元，
申请(专利权)人：山东铂源生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：