一种多基因串联法创制完全降解1,2-二氯乙烷工程菌的方法及应用技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体涉及一种多基因串联法创制完全降解1,2

【技术实现步骤摘要】
一种多基因串联法创制完全降解1,2
‑
二氯乙烷工程菌的方法及应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种多基因串联法创制完全降解1,2
‑
二氯乙烷工程菌的方法及应用。

技术介绍

[0002]1,2
‑
二氯乙烷(1,2
‑
dichloroethane；1,2
‑
DCA)属卤代烃类化合物，无色透明油状液体，有类似氯仿的气味，能与甲醇等有机溶剂混溶，微溶于水，易挥发，高毒，可致癌，易燃，已被EPA列为优先控制的有毒污染物名单之中。工业上所用到的1,2
‑
DCA都是由人工合成而来，在应用过程中的不正确处理常导致1,2
‑
DCA通过废水的形式进入环境中，对环境造成严重的污染。此外，1,2
‑
DCA还是一种潜在的诱变剂和致癌物质。随着工业的快速发展，1,2
‑
DCA的应用带来的环境问题日益严重，因此，寻找高效处理1,2
‑
DCA的方法具有广泛的应用前景。
[0003]传统的处理方法包括物理吸附和化学裂解，但是效率较低、成本较高，相比之下，生物处理法则具有显著的优势，效率高、能耗低且不会产生二次污染。1983年，1,2
‑
DCA降解模式菌XanthobacterautotrophicusGJ10被成功分离，到目前为止，报道的1,2
‑
DCA降解菌属有Ancylobactersp.、Pseudomonassp.等，但这些菌株存在着亲和力低、降解不稳定等自身缺陷，导致应用程度较低。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种多基因串联法创制完全降解1,2
‑
二氯乙烷工程菌的方法及应用，创制的工程菌可完全降解1,2
‑
二氯乙烷，降解效率高。
[0005]本专利技术提供了一种完全降解1,2
‑
二氯乙烷的融合基因，形成所述融合基因的原始基因包括XaDhlA基因、XaADH基因、XaALDH基因、XaDhlB基因、CrGYD1基因和GmMS基因。
[0006]优选的，所述XaDhlA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述XaADH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述XaALDH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述XaDhlB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述CrGYD1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述GmMS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
[0007]优选的，所述原始基因在进行融合前，还包括进行密码子优化，经优化后的XaDhlA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，经优化后的XaADH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，经优化后的XaALDH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，经优化后的XaDhlB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，经优化后的CrGYD1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，经优化后的GmMS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
[0008]本专利技术还提供了一种包含上述融合基因的多基因表达盒。
[0009]优选的，将每个经密码子优化后的原始基因分别与T7启动子和终止子融合，构建得到6个表达盒，并进行连接。
[0010]优选的，所述连接的顺序从5
’
端至3
’
端，包括：经密码子优化后的XaDhlA表达盒、经密码子优化后的XaADH表达盒、经密码子优化后的XaALDH表达盒、经密码子优化后的XaDhlB表达盒、经密码子优化后的CrGYD1表达盒和经密码子优化后的GmMS表达盒。
[0011]本专利技术还提供了一种包含上述多基因表达盒的重组载体。
[0012]本专利技术还提供了一种表达上述融合基因或包含上述重组载体的重组工程菌。
[0013]本专利技术还提供了一种完全降解1,2
‑
二氯乙烷的重组大肠杆菌工程菌，所述重组大肠杆菌工程菌表达上述融合基因或包含上述重组载体。
[0014]本专利技术还提供了上述重组工程菌或上述重组大肠杆菌工程菌在完全降解1,2
‑
二氯乙烷中的应用。
[0015]有益效果：本专利技术提供了一种完全降解1,2
‑
二氯乙烷的融合基因，对目前已知的降解1,2
‑
二氯乙烷功能的6个基因进行结构优化和化学合成，并创制了含有6个基因的多基因表达盒，以及表达所述融合基因的重组大肠杆菌工程菌。本专利技术实施例中通过DNA的PCR验证，所述融合基因的6个外源基因均整合到大肠杆菌基因组中，进一步通过摇瓶发酵实验和同位素示踪法验证来检验其降解1,2
‑
二氯乙烷的能力，结果显示2mM1,2
‑
二氯乙烷在12h内被完全降解。
附图说明
[0016]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0017]图1为1,2
‑
二氯乙烷降解流程图；
[0018]图2为PCR鉴定结果图；
[0019]图3为1,2
‑
二氯乙烷降解效果图；
[0020]图4为中间代谢产物乙醇酸检测图；
[0021]图5为同位素标记代谢检测结果图。
具体实施方式
[0022]本专利技术提供了一种完全降解1,2
‑
二氯乙烷的融合基因，形成所述融合基因的原始基因包括XaDhlA基因、XaADH基因、XaALDH基因、XaDhlB基因、CrGYD1基因和GmMS基因。
[0023]本专利技术所述融合基因的组成基因中，XaDhlA基因编码的卤代烷烃脱卤酶将1,2
‑
二氯乙烷转化为2
‑
氯乙醇、XaADH基因编码的乙醇脱氢酶将2
‑
氯乙醇转化为2
‑
氯乙醛、XaALDH基因编码的乙醛脱氢酶将2
‑
氯乙醛转化为氯乙酸、XaDhlB基因编码的卤乙酸脱卤酶将氯乙酸转化为乙醇酸、莱茵衣藻CrGYD1基因编码乙醇酸脱氢酶，催化乙醇酸生成乙醛酸、大豆GmMS基因编码苹果酸合成酶，催化乙醛酸和乙酰coA生成苹果酸，苹果酸直接进入TCA循环，为细菌所利用，从而完成1,2
‑
二氯乙烷的完全降解。
[0024]在本专利技术中，各原始基因的核苷酸序列分别如下所述：所述XaDhlA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述XaADH基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，所述XaALDH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种完全降解1,2
‑
二氯乙烷的融合基因，其特征在于，形成所述融合基因的原始基因包括XaDhlA基因、XaADH基因、XaALDH基因、XaDhlB基因、CrGYD1基因和GmMS基因。2.根据权利要求1所述融合基因，其特征在于，所述XaDhlA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述XaADH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述XaALDH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述XaDhlB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述CrGYD1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述GmMS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。3.根据权利要求1或2所述融合基因，其特征在于，所述原始基因在进行融合前，还包括进行密码子优化，经优化后的XaDhlA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，经优化后的XaADH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，经优化后的XaALDH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，经优化后的XaDhlB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，经优化后的CrGYD1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，经优化后的G...

【专利技术属性】
技术研发人员：张文慧，张长波，田永生，姚泉洪，彭日荷，邓永东，付晓燕，许晶，王波，李振军，高建杰，韩红娟，王丽娟，王宇，左志豪，钱岑，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：