一种细胞消化终止液及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开一种细胞消化终止液及其制备方法和应用。所述细胞消化终止液以磷酸盐缓冲液PBS为初始溶液，添加如下成分：CaCl

【技术实现步骤摘要】
一种细胞消化终止液及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及细胞的消化终止，特别涉及一种细胞消化终止液及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]贴壁细胞在培养瓶长成致密单层后，继续生长的空间不足，培养基中的营养成份也消耗较多，同时代谢废物也有较多堆积，此时需要对细胞进行分散收集，进一步冻存或者传代。细胞消化一般使用酶消化法(胰蛋白酶消化及胶原蛋白酶消化)，此方法作用于细胞间的蛋白连接；离子螯合剂法，不破坏细胞表面分子，螯合细胞连接蛋白里的离子。对于贴壁较紧的细胞如成纤维细胞，则需要以胰酶消化后再吹散分瓶，一般过程为(以下操作均按无菌操作的要求进行)：将长成致密单层细胞的细胞瓶中原来的培养液弃去，用PBS清洗两遍培养瓶；视细胞瓶的大小加入一定体积一定浓度的胰酶溶液，以使充分浸润；一般消化时间约为1至3分钟，肉眼观察瓶壁半透明的细胞层，当见到出现细针孔空隙时，弃去胰酶溶液，并加入适量的细胞培养液终止消化。
[0003]消化对于之后的细胞状态影响很大，其中终止消化液的作用至关重要。传统方式使用PBS或生理盐水终止消化(此方法对细胞破坏极大，会导致细胞较快速的老化失去增殖能力)，或用完全培养基及培养上清(使用完全培养基及培养上清成本较大，对于消化液的终止不彻底，还是会对细胞产生比较明显的破坏，再者使用培养上清时需过滤或者高速离心去除杂质方能使用，较为繁琐)。
[0004]因此，在细胞消化时做到彻底的终止消化液作用，操作简便，成本低十分重要。本专利技术着重解决消化对于细胞状态的影响，使得细胞始终保持较好的状态。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的终止消化液对消化液的终止不彻底，且会对细胞产生比较明显的破坏等技术问题，本专利技术提供一种细胞消化终止液及其制备方法和应用，所述细胞消化终止液能有效终止消化液的消化作用，且能较好地保持细胞的初始状态。
[0006]本专利技术的细胞消化终止液，以磷酸盐缓冲液PBS为初始溶液，以保持细胞pH以及渗透压，添加如下成分：CaCl
2 50
‑
300mg/L，MgCl
2 50
‑
300mg/L，过量的钙镁离子能够与螯合剂结合，使得螯合剂不再作用于细胞上的钙镁离子，从而达到终止作用；胰蛋白酶抑制剂50
‑
300mg/L，实现抑制胰蛋白酶的作用，Ⅰ型胶原蛋白100
‑
500mg/L，人血白蛋白100
‑
1000mg/L，用于饱和式作用消化液中的酶，各成分共同发挥作用，有效终止消化液的消化作用。
[0007]运用上述终止液处理的细胞，在至少5个代次细胞连续传代中始终保持较高的增殖能力，较稳定的细胞大小维持。
[0008]上述的细胞消化终止液的制备方法，包括如下步骤：
[0009]以磷酸盐缓冲液PBS分别配制CaCl2、MgCl2、胰蛋白酶抑制剂、Ⅰ型胶原蛋白和人血白蛋白；然后以以磷酸盐缓冲液PBS为初始溶液，控制溶液中的各物质满足上述浓度要求。
[0010]进一步地，所述胰蛋白酶抑制剂是抑制胰蛋白酶的丝氨酸蛋白酶抑制剂，可能是外源性或内源性化合物，包括：α
‑
抗胰蛋白酶、抑蛋白酶多肽、Chemicalbook卵黏蛋白、BowmarrBirk大豆胰蛋白酶抑制物、Kazal胰腺胰蛋白酶抑制物、Kunitz大豆胰蛋白酶抑制物等。
[0011]上述细胞消化终止液应用于细胞消化终止中，即能够对细胞有较好的保护作用，且随着时间增长也没有明显的损伤作用。
[0012]进一步地，所述细胞为P0代细胞或P1以上代细胞(包括P0代细胞、P1代细胞、P2代细胞、P3代细胞、P4代细胞、P5代细胞及更高代次细胞)。
[0013]与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
[0014]本专利技术的细胞消化终止液各组分互相配合，共同发挥作用：Mg
2+
、Ca
2+
离子能结合消化液中残留的EDTA，保护细胞不再被残留的EDTA损伤；胰蛋白酶抑制剂可以使消化液中的酶成分失去活性，终止酶对细胞的损伤作用；Ⅰ型胶原蛋白和人血白蛋白作为蛋白添加剂可以使残留的酶处于过饱和于酶的蛋白环境中，保证残留的酶不再作用于细胞，另外可与PBS一起作为细胞缓冲剂保证细胞渗透压，pH等。
[0015]本专利技术的细胞消化终止液所有成分明确，具有非常高的可控性，安全性和稳定性。
附图说明
[0016]图1为P0代细胞的放大照片。
[0017]图2为使用本专利技术实施例1所得细胞消化终止液连续处理至P5代次时细胞96小时的放大照片，细胞呈明显梭状，轮廓清晰，大小均一，边界分明。
[0018]图3为使用培养上清连续处理至P5代次时细胞96小时的放大照片，细胞部分老化，铺满后梭状不明显，轮廓较模糊，边界不明显。
[0019]图4为使用生理盐水连续处理至P5代次时细胞96小时的放大照片，细胞大部分老化，老化部分没有明显的梭状，细胞边缘模糊不清，经过96小时生长未能铺满平面。
[0020]图5为各组细胞随代次递增的直径变化趋势图，直径变化曲线由上至下分别对应于A、B、C。
[0021]图6为各组细胞随代次递增数量倍增数变化图，每组倍增数从左至右对应于A、B、C。
[0022]图7为各组细胞处理培养96小时后的平均直径，每组直径从左至右对应于30min(a、b、c、d)；60min(a、b、c、d)。
[0023]图8为各组细胞处理培养96小时后的倍增数，每组倍增数从左至右对应于30min(a、b、c、d)；60min(a、b、c、d)。
具体实施方式
[0024]下面结合附图和具体实施例对本专利技术做进一步详细说明，但本专利技术并不限于此。
[0025]实施例1
[0026]细胞消化终止液及其制备
[0027]组成：NaCl 8g/L，KCl 0.2g/L，KH2PO4 0.27g/L，Na2HPO
4 1.44g/L，CaCl
2 100mg/L，MgCl
2 100mg/L，胰蛋白酶抑制剂100mg/L，Ⅰ型胶原蛋白100mg/L，人血白蛋白500mg/L。
[0028]制备：以磷酸盐缓冲液PBS为初始溶液，控制各物质的浓度满足上述要求。
[0029]实施例2
[0030]组成：NaCl 8g/L，KCl 0.2g/L，KH2PO4 0.27g/L，Na2HPO
4 1.44g/L，CaCl
2 50mg/L，MgCl
2 50mg/L，胰蛋白酶抑制剂50mg/L，Ⅰ型胶原蛋白150mg/L，人血白蛋白100mg/L。
[0031]制备：以磷酸盐缓冲液PBS为初始溶液，控制各物质的浓度满足上述要求。
[0032]实施例3
[0033]组成：NaCl 8g/L，KCl 0.2g/L，KH2PO4 0.27g/L，Na2HPO
4 1.44g/L本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种细胞消化终止液，其特征在于，以磷酸盐缓冲液PBS为初始溶液，添加如下成分：CaCl
2 50
‑
300mg/L，MgCl
2 50
‑
300mg/L，胰蛋白酶抑制剂50
‑
300mg/L，Ⅰ型胶原蛋白100
‑
500mg/L，人血白蛋白100
‑
1000mg/L。2.权利要求1所述的细胞消化终止液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：以磷酸盐缓冲液PBS分别配制CaCl2、MgCl2、胰蛋白酶抑制剂、Ⅰ型胶原蛋白和人血白蛋白；然后以磷酸盐缓冲液PBS为初始溶液，再控制溶液中的各物质满足如下浓度要求：CaCl250
‑
300mg/L，MgCl
2 50
‑...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵朝伟，张舒乐，黄青，吴定，石慧娟，李海，李鸿颖，
申请(专利权)人：湖南开启时代科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：