一种利用片状载体培养工艺生产轮状病毒疫苗的方法技术

本发明专利技术提供了一种轮状病毒的生产方法，具体地，提供了一种轮状病毒在配置有片状载体的生物反应器中的培养方法。本发明专利技术的方法通过灌流避免了细胞培养过程残留血清对轮状病毒培养过程中胰酶成分的影响，确定了胰酶的使用浓度及不同阶段的灌流速度，最终在高密度细胞的情况下接毒，并获得了高滴度、高产量的轮状病毒收获液。减少了目前轮状病毒疫苗生产中细胞工厂工艺人工操作繁琐、工作量大，病毒滴度低等问题。等问题。

【技术实现步骤摘要】
一种利用片状载体培养工艺生产轮状病毒疫苗的方法


[0001]本专利技术涉及生物医药及生物
，具体地，涉及一种利用片状载体培养工艺生产轮状病毒疫苗的方法。

技术介绍

[0002]轮状病毒(Rotavirus，RV)是一种感染范围极广的消化道病毒；根据VP6抗原性(位于中间衣壳，具有高度的保守性)的不同，可以将RV分为A，B，C，D，E，F和G共7个组，A组和B组可以感染人，其中，A组是引起婴幼儿感染和重症腹泻的主要病原，B组可以感染成人并造成腹泻，C组主要引起散发性的腹泻；D
‑
G组仅感染动物。
[0003]RV疫苗免疫可以显著的降低婴幼儿因RV感染而造成的重症腹泻的比例。大多数RV疫苗株的复制是胰酶依赖性的，这是由于RV的融合素蛋白VP4在胰酶作用下才能高效的裂解为带氨基末端的VP8和带羧基末端的VP5，而这两个片段在病毒入侵宿主细胞的初期起着重要的作用。RV的病毒扩增工艺成为RV疫苗生产过程中的核心工艺。
[0004]由于大部分的RV疫苗株都能引起细胞病变，且有相当的RV病毒粒子存在于细胞内；为了更多的获得病毒粒子，传统的RV细胞工厂生产工艺和微载体生物反应器生产工艺都是在病毒培养完毕后将病毒液与细胞一同收集，再通过各种技术手段将细胞破碎使得RV病毒粒子更多的释放到收获液中。这些工艺就会造成细胞蛋白、核酸和亚细胞结构等杂质更过的存在于病毒收获液中，为后期的纯化带来了巨大的技术困难，需要尽可能的去除这些杂质。一方面使得纯化过程更为复杂，一方面也给疫苗的质量控制带来了更多的风险。
[0005]此外，无论是细胞工厂工艺还是微载体生物反应器工艺，在清除细胞培养阶段的FBS的阶段，操作难度都较大，细胞很容易在清洗过程中脱落而影响整个病毒培养工艺的顺利进行。
[0006]因此，本领域亟待开发一种新的轮状病毒疫苗生产方法。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种便捷高效的生产轮状病毒疫苗的方法。
[0008]本专利技术的第一方面，提供了一种轮状病毒生产方法，所述方法包括以下步骤：
[0009](a)提供一生物反应器，所述生物反应器中配置有片状载体，并且所述生物反应器设有可打开和闭合的进样口和出样口，所述生物反应器的工作体积为V0；
[0010](b)将宿主细胞以5*105‑
1.5*106个细胞/ml的细胞密度接种至所述生物反应器中，加入第一培养液培养7
‑
9天，从培养第3天开始灌流培养，从而获得高细胞密度的附着于片状载体的宿主细胞；
[0011](c)将所述附着于片状载体的宿主细胞的培养上清液从出样口排尽，用第一洗涤液对所述附着于片状载体的宿主细胞洗涤后，使用6*V0体积的第二洗涤液持续灌流所述生物反应器，排空生物反应器中的上清液后，将第二培养液加入所述生物反应器中；
[0012](d)提供活化的轮状病毒种毒，将所述活化的轮状病毒接种至所述生物反应器中
的第二培养液中，接种MOI为0.001
‑
0.01，较佳地为0.003；
[0013](e)在病毒接种12
‑
16h后，使用新鲜的第二培养液对所述生物反应器进行持续灌流，同时收集灌流过程中的流出液，即获得含有所述轮状病毒的病毒收获液，其中所述灌流的灌流速度为v1，灌流时间为6
‑
8天。
[0014]在另一优选例中，所述生物反应器的培养条件设置为温度37℃、pH 7.2、DO 50％、搅拌速度100rpm。
[0015]在另一优选例中，所述轮状病毒选自下组：CDC
‑
9、CDC
‑
66或其组合。
[0016]在另一优选例中，所述轮状病毒为CDC
‑
9。
[0017]在另一优选例中，所述宿主细胞为Vero细胞。
[0018]在另一优选例中，在步骤(b)中，将宿主细胞以5*105个/ml的细胞密度接种至所述生物反应器中。
[0019]在另一优选例中，在步骤(b)中，所述灌流培养的方法为：将新鲜的第一培养液从所述生物反应器的进样口加入，同时打开出样口，使所述附着于片状载体的宿主细胞的培养上清液从出样口排出。
[0020]在另一优选例中，在步骤(b)中，灌流培养过程中所述附着于片状载体的宿主细胞的培养上清液中的葡萄糖浓度不低于2g/L。
[0021]在另一优选例中，在步骤(b)中，灌流培养过程需每24h检测反应器内及灌流出液的葡萄糖浓度，从而计算葡萄糖消耗量R，具体计算公式为：
[0022][0023]其中R为每24h反应器内细胞的单位葡萄糖消耗量，单位g/L；
[0024]G0为24h前反应器内培养液的葡萄糖浓度，单位g/L；
[0025]G1为反应器内培养液的葡萄糖浓度,单位g/L；
[0026]V0为反应器的工作体积，单位L；
[0027]G2为基础培养基的葡萄糖浓度,单位g/L；
[0028]G3为灌流出液中葡萄糖浓度，单位g/L；
[0029]V2为24h灌流出液的体积，单位L。
[0030]在另一优选例中，在步骤(c)中，所述洗涤的方法为：将第一洗涤液从所述生物反应器的进样口加入，搅拌5
‑
15min，然后使洗涤液从出样口排出。
[0031]在另一优选例中，在步骤(c)中，洗涤的次数为2
‑
4次。
[0032]在另一优选例中，在步骤(c)中，所述灌流的方法为：将第二洗涤液从所述生物反应器的进样口加入，同时打开出样口，使所述生物反应器内的上清液从出样口排出。
[0033]在另一优选例中，在步骤(c)中，当灌流结束时，所述生物反应器内上清液的BSA含量不大于100ng/ml，较佳地不大于50ng/ml。
[0034]在另一优选例中，在步骤(d)中，所述活化的轮状病毒种毒按照以下方法制备：
[0035]将轮状病毒种毒加入到含有15μg/ml胰酶和800μg/ml氯化钙的活化液中，置于37℃活化1.0
‑
2.0h，从而获得活化的轮状病毒种毒。
[0036]在另一优选例中，在步骤(e)中，所述灌流的方法为：将新鲜的第二培养液从所述生物反应器的进样口加入，同时打开出样口，使所述生物反应器内的上清液从出样口排出，
通过泵来控制进出液的速度，保持反应器内培养液总体积恒定。
[0037]在另一优选例中，所述第一培养液为含有8％
‑
10％FBS的基础培养基。
[0038]在另一优选例中，所述第二培养液为含有20
‑
30μg/ml胰酶的基础培养基。
[0039]在另一优选例中，所述第二培养液为含有30μg/ml胰酶的基础培养基。
[0040]在另一优选例中，所述第一洗涤液选自下组：PBS缓冲液、无血清的基础培养基。
[0041]在另一优选例中，所述第二洗涤液为本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种轮状病毒生产方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(a)提供一生物反应器，所述生物反应器中配置有片状载体，并且所述生物反应器设有可打开和闭合的进样口和出样口，所述生物反应器的工作体积为V0；(b)将宿主细胞以5*105‑
1.5*106个细胞/ml的细胞密度接种至所述生物反应器中，加入第一培养液培养7
‑
9天，从培养第3天开始灌流培养，从而获得高细胞密度的附着于片状载体的宿主细胞；(c)将所述附着于片状载体的宿主细胞的培养上清液从出样口排尽，用第一洗涤液对所述附着于片状载体的宿主细胞洗涤后，使用6*V0体积的第二洗涤液持续灌流所述生物反应器，排空生物反应器中的上清液后，将第二培养液加入所述生物反应器中；(d)提供活化的轮状病毒种毒，将所述活化的轮状病毒接种至所述生物反应器中的第二培养液中，接种MOI为0.001
‑
0.01，较佳地为0.003；(e)在病毒接种12
‑
16h后，使用新鲜的第二培养液对所述生物反应器进行持续灌流，同时收集灌流过程中的流出液，即获得含有所述轮状病毒的病毒收获液，其中所述灌流的灌流速度为v1，灌流时间为6
‑
8天。2.如权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：安祺，田大勇，阮俊程，张雅春，郭跃，
申请(专利权)人：北京赛尔富森生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：